3讨论

    新生血管形成是个极其复杂的病理生理过程，它涉及血管内皮细胞的活化、增殖、迁移，血管管腔形成等。一些生长因子如血管内皮生长因子(VEGF) 、血栓反应素－1、色素上皮分离因子（PEDF）、bFGF、TGF-β、一氧化氮（NO）、基质金属蛋白酶家族（MMPs）等均参与了新生血管的形成。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是机体在低氧环境下启动对低氧产生适应性反应的关键物质，通过与HRE结合,诱导其下游基因VEGF的表达增强，在缺血性视网膜新生血管的形成中发挥着重要的作用[4]。由l20kDa的α亚基和91/93/94kDa的β亚基组成，其中HIF-lα是主要的功能亚基，HIF-1的活性主要是由HIF-lα的蛋白质水平和活性决定的;而β亚基则属于结构亚基。在血管的发育过程中,HIF-1对血管新生也起重要作用[5],它是VEGF的转录活化因子,通过转录活化编码VEGF基因而刺激血管新

    图 1 FITC-Dextran荧光照影视网膜铺片 A：A组P19小鼠视网膜血管基本成熟,自视盘发出的血管向四周呈放射状均匀分布，交叉成网状，分深浅两层，浅层血管较细，呈分支状；深层血管较粗，呈网状；B，C：B、C组P19小鼠视网膜大血管不规则扩张，走行迂曲，中周部大片无灌注区，可见新生血管丛，伴荧光渗漏；D：D组P19小鼠视网膜血管网状结构基本可见，血管迂曲及不规则扩张较B、C组明显减轻，无灌注区及新生血管丛明显减少，视网膜血管网状结构基本正常

    图 2 小鼠视网膜HIF-1α蛋白质的表达差异（SP×400） A：A组P12小鼠视网膜中HIF-1α蛋白表达阴性；B，C：B、C组HIF-1α蛋白表达呈阳性，主要表达在神经节细胞层；D：D组HIF-1α蛋白表达明显减少。

    生[6]。因此, HIF-1也被称为VEGF的管家转录因子。缺乏 HIF-1的表达, VEGFmRNA水平显著降低;即使在缺氧条件下, VEGFmRNA也未被诱导表达[7]。Ozaki等[8]在缺氧建立的缺血性视网膜病变的小鼠模型研究中发现,视网膜内HIF-1α水平于缺氧2h时达最高峰，缺氧24h时HIF-1α水平回到基线水平，而VEGF于缺氧6h后在内核层表达增强,且持续增高数十天，表明对于缺血性视网膜病变HIF-1α水平的增加与VEGF表达的增强在时间和空间上密切相关，HIF-1α介导的VEGF上调在缺血性视网膜病变的发展中起着重要作用。Masuda等[9]发现，质粒包裹于脂质体中，转染至视网膜24h开始表达；因此，本试验选择HIF-lα为靶点，在小鼠出氧舱前1d向小鼠玻璃体腔注射HIF-1α siRNA重组质粒-脂质体复合物，旨在揭示当HIF-lα处于高峰表达时，pSUPERsiHIF-1α对其及视网膜新生血管的抑制作用。

    RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。研究显示，dsRNA通过两种机制抑制细胞蛋白质的合成。第一种为非特异性途径，大于30bp的双链RNA进入细胞后可以激活干扰素应答系统，从而活化RNA依赖的蛋白激酶，乃至广泛抑制细胞蛋白质合成。第二种为特异性途径，外源性或内源性dsRNA在细胞内被一种RNA酶Ⅲ-Dicer结合，随即被切割成21～23核苷酸的短链RNA，即小片段干扰RNA（small interferingRNA, siRNA）[10]。siRNA与Dicer结合形成RISC复合体 (RNA induced silencingcomplex)，siRNA作为引导序列，识别靶基因转录出的mRNA，并引导RISC复合体与mRNA结合，核酸酶Dicer将mRNA切割成21～23nt的片段，从而特异性地抑制靶基因的表达。而新产生的双链RNA可再次形成RISC复合体，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应，引发“基因沉默”。 基于对siRNA研究的不断深入及其在抑制视网膜血管新生方面的潜在价值，本研究构建了HIF-1α的siRNA质粒，旨在通过基因沉默下调视网膜HIF-1α的表达,进而使其下游基因VEGF表达降低，从而抑制视网膜新生血管。

    在本实验中，正常组视网膜未见明显HIF-1α蛋白阳性表达，说明在常氧条件下, HIF-1α 由结构中的氧依赖降解结构域(ODD) 控制,并通过泛素- 蛋白酶体途径迅速降解[11]。缺氧2h后，对照组和空载体组视网膜HIF-1α蛋白呈阳性表达，主要表达于节细胞的胞核。这可能是节细胞层对组织缺氧最敏感,而HIF-1α在缺氧的细胞内积聚,并与HIF-1β形成二聚体,通过HIF-1αC 末端的转录激活区域(C-TAD) 诱导辅激活蛋白CBP/ P300 从胞浆进入胞核,共同形成大分子复合物,并与缺氧反应基因的缺氧反应元件( HRE) 上的HIF-1 结合位点(5′- TACGTG-3′) 结合,促进缺氧反应基因的转录,引起细胞对缺氧的一系列适应性反应[12]。当pSUPERsiHIF-1α转染视网膜后，HIF-1α蛋白合成明显受抑制,胞核显棕色的细胞数量及程度明显减少，且视网膜新生血管受到明显抑制。因而证实了HIF-1α siRNA能有效抑制HIF-1α的表达和视网膜新生血管的形成；另一方面HIF-1α siRNA在缺氧环境中亦能发挥RNA干扰效应。我们通过体外重组HIF-1α特异性siRNA，采用玻璃体注射途径，有效地下调了视网膜HIF-1α蛋白质的表达，以及抑制了视网膜新生血管的形成，因而为有效抑制眼内新生血管的形成提供了新的途径。但是如何选择高效基因表达系统，提高转染效率及安全性，以达到眼内新生血管的彻底根除等相关问题尚待进一步研究。

    【参考文献】

    1 Boyd SR, Tan D, Bunce C, Gittos A, Neale MH, Hungerford JL, Charnock-Jones S and Cree IA. Vascular endothelial growth factor is elevated in ocular fluids of eyes harbouring uveal melanoma:identification of a potential therapeutic window. Br J Ophthalmol ,2002;86(4):448-452

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    8 Ozaki H, Yu AY, Della N,Ozaki K,Luna JD,Yamada H,Hackett SF,Okamoto N,Zack DJ,Semenza GL,Campochiaro PA. Hypoxia inducible factor-1alpha is increased in ischemic retina: temporal and spatial correlation with VEGF expression. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1999;40(1):182-189

    9 Masuda I, Matsuo T, Yasuda T,Matsuo N. Gene transfer with liposomes to the intraocular tissues by different routes of administration. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1996;37(9):1914-1920

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    11 Huang LE, Arany Z, Livingston DM, and Bunn HF.Activation of hypoxia- inducible transcription factor depends primarily upon redox-sensitive stablilization of its alpha subunit. J Biol Chem ,1996;271 (50): 32253-32259

    12 Huang LE, Bunn HF. Hypoxia-inducible factor and its biomedical relevance. JBC Papers in Press ,2003;278(22):19575-19578

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