作者：姜廷帅 蔡莉 惠延年 闫峰
作者单位：作者单位:(710032) 中国陕西省西安市，第四军医大学西京医院眼科
Study on transdifferentiation of rat's mesenchymal stem cells into corneal epithelial cells in vitro
Ting-Shuai Jiang , Li Cai, Yan-Nian Hui, Feng Yan
Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
AbstractAIM: To explore the plasticity of transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSC) into corneal epithelial cells. METHODS: MSC of adult rats that were isolated and purified by density gradient centrifugation combined with an attachment culture method. The transdifferentiation of MSC into corneal epithelial cells were induced in vitro by co-cultured with corneal stromal fibroblasts. The expression of K12 on MSCs which is expressed specially in corneal epithelial cells was identified by immunofluorescent staining. RESULTS: MSC cultured in vitro showed great potential of proliferation. CD29 was positive, and CD34, CD45 were negative in cultured cells, indicating that the cultured cells were MSC. After co-cultured with corneal stromal fibroblasts for one week, MSC expressed K12, indicating that they had been transdifferentiated into corneal epithelial cells. CONCLUSION: The data suggests that MSC have the potential to transdifferentiate into corneal epithelial cells in vitro.
· KEYWORDS: mesenchymal stem cell; corneal epithelial cells; transdifferentiation
摘要目的:探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性。方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSC，经体外与角膜基质细胞共培养诱导分化，免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达。 结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能，原代培养的骨髓MSC CD29免疫荧光染色阳性，CD34和CD45为阴性，符合骨髓MSC的特征。MSC与角膜基质细胞共培养1wk后大部分细胞分化为间质细胞，少部分细胞形态上相对偏小，免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12。 结论:体外培养的MSC在角膜基质细胞的诱导下可横向分化为角膜上皮细胞。
关键词:骨髓间充质干细胞；角膜上皮；细胞分化
0引言
角膜上皮再生的来源是角膜缘干细胞，角膜缘干细胞的缺失会导致严重的眼表异常。采用自体或同种异体角膜缘移植，可一定程度的重建眼表，但因供体来源不足及异体移植引起的排斥反应而受限；而单纯羊膜移植重建眼表，因无上皮再生来源的干细胞而不能治疗角膜缘严重受损的眼表损伤。组织工程技术的发展为解决这一问题带来了希望。成年人骨髓中存在着多向潜能的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞。我们对骨髓MSC向角膜上皮细胞的分化潜能做一些初步的探索，从而探讨骨髓MSC作为构建组织工程化角膜的种子细胞的可行性。
1材料和方法
1.1材料 PBS液(含青链霉素100kU/L)；细胞培养基(DMEM/Ham’s F12 ,10 mL/L胎牛血清)；2.5g/L胰蛋白酶；中性蛋白酶dispaseⅡ；Percoll储存液（密度1077g/L）；兔抗大鼠CD29，CD34，CD45mAb（美国Chemicon公司）、兔抗大鼠角蛋白K12mAb（美国Santa Cruz公司），山羊抗兔FITC标记二抗（北京中山生物技术公司），跨室培养装置（Transwell，孔径0. 45μm，美国Millipore公司）。
1.2方法
1.2.1大鼠骨髓MSC的分离培养 取4wk龄SD大白鼠，雌雄不限，断颈处死后于750mL/L乙醇中浸泡10min。无菌条件下用外科剪于大鼠的股骨端将大腿剪下，剪去胫骨，用眼科剪剪开皮肤，分离去除肌肉，剪去股骨两端的膨隆部分，暴露骨髓腔，用含肝素的PBS液冲洗骨髓腔，收集于培养皿，如此反复数次。在一无菌离心管中，加入Percoll液0.6mL和8.5g/L NaCl溶液0.4mL，混匀配制成密度为1 077g/L的细胞密度梯度分离液。将收集的细胞悬液缓慢加在分离液的上部，2 000r/min离心30min，去除上清。PBS洗2次，按2×108/L密度接种细胞于75mL塑料培养瓶中。接种48h后换液，以后每2～3d换液，观察细胞增殖能力及形态学特征（倒置显微镜）。另将原代培养的MSC接种于盖玻片上，待细胞长出后，用PBS离心洗涤 （1 000r/min，5min）2次，把细胞片浸入950mL/L乙醇中固定。将已经固定的细胞玻片放入盖片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。滴加滴度为1∶32～64的特异性抗体(一抗，CD29，CD34，CD45，K12)，置于湿盒内，37℃保温孵育60min，另以PBS代替一抗作阴性对照。随后PBS振洗3次，吹干。滴加适当稀释的荧光素标记抗体（二抗，FITC标记的山羊抗兔IgG），置于湿盒内，37℃保温30min。PBS振洗2次，然后用蒸馏水振洗1次。500mL/L缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察并照相记录。
1.2.2角膜基质细胞的制备 无菌条件下摘取大鼠眼球，沿角膜缘处分离出整个角膜，先用普通消化液浸泡，置于37℃30min ，再用dispaseⅡ于37℃消化2～3h 。消化后用PBS 洗去消化下来的上皮细胞。在显微镜下观察，若发现细胞未消化干净，用眼科小镊子轻轻刮取细胞，确保角膜上皮细胞完全被消化下来。将角膜基质剪成1mm×1mm大小的组织块，放入离心管中加入4mL胶原酶，将离心管倾斜放入37℃孵箱内，每隔5min振摇一次，消化1h。收集消化液，过100目不锈钢网过滤，800r/min离心，5min，去除上清，用PBS离心漂洗1～2次，去除上清，按1×107/L密度接种于25mL培养瓶中。
1.2.3大鼠骨髓MSC与角膜基质细胞共培养 按Millipore公司的说明，用Transwell共培养体系（跨室培养器，孔径0.45μm）装置进行大鼠骨髓间充质干细胞与角膜基质细胞的共培养。共培养体系中上、下层的细胞被隔开，培养液和可溶性因子可以自由通过，细胞无法通过。在6孔培养板中以1×108/L的密度接种第2代MSC，其中3个孔放置Transwell小室作为诱导组，另外3个孔不放置Transwell小室作为对照组。在Transwell小室中接种大鼠角膜基质细胞（第2代），滴加40μg/L表皮生长因子（EGF），共培养7d后，间接免疫荧光法检测抗角膜上皮细胞特异性角蛋白K12在与角膜缘基质细胞共培养的骨髓间充质干细胞中的表达（方法同前）。
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