作者：张璐琰 郑玉萍 熊全臣 冯朝晖 熊 蕾 王肖华
作者单位：（710004）中国陕西省西安市，西安交通大学第二医院眼科
【摘要】 目的：探讨整合素链激酶（integrinlinked kinase, ILK）在大鼠外伤性白内障形成过程中的作用。方法：取15只正常大鼠（体质量250～300g），建立单眼外伤性白内障模型，并随机分为伤后1，3，7d 3个时相组,用免疫组化法检测ILK在各组晶状体上皮细胞中的表达。 结果：晶状体混浊在外伤后1d即开始出现，并随时间延长而加重。ILK在各外伤组晶状体上皮细胞中均有较强的阳性表达。而未行手术的对照眼ILK表达为阴性。 结论：晶状体穿通伤后ILK参与了外伤性白内障形成的病理环节。
【关键词】 ILK 外伤性白内障 晶状体上皮细胞
0引言
外伤性白内障是眼球发生穿孔伤或顿挫伤后常见的并发症之一，其发病率为36%～52%，也是眼外伤致盲的主要原因之一，占视力致残者的28.1%。许多研究表明机械性损伤引起的晶状体上皮细胞增生、移行和化生与外伤性白内障的发生发展密切相关。整合素链激酶（integrinlinked kinase,ILK）是一种多功能蛋白,参与多种信号传导通路,在调节细胞周期、细胞黏附、迁移、基质积聚等过程中起重要作用，是多种纤维化疾病发生过程中重要的信号分子[1]。但目前尚无ILK在外伤性白内障中作用的研究。本实验通过建立大鼠单眼外伤性白内障模型, 应用免疫组织化学法检测了外伤性白内障中晶状体上皮细胞中ILK的表达情况。
1材料和方法
1.1材料 正常成年SD大鼠15只，雌雄不限，体质量250～300g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供,兔抗鼠ILK单克隆抗体（Cell Signaling公司），DAB 显色试剂盒（北京博奥森生物技术公司）。
1.2方法
1.2.1制作鼠外伤性白内障模型 正常成年大鼠15只, 雌雄不限,均在左眼进行人为外伤制造外伤性白内障。对侧眼作为对照眼。方法如下：5g/L 托品酰胺扩瞳, 5g/L 氯胺酮按10mL/kg 比例腹腔注射麻醉,5g/L 利多卡因滴眼, 实验眼在手术显微镜下用27G注射针头在角膜偏中央部位刺穿角膜, 并用针头将晶状体前囊划开1.0mm×1.5mm 切口,再用针头自晶状体中央沿前囊创口长轴方向划开数次, 术毕结膜囊涂红霉素眼膏,术后每天5g/L 托品酰胺扩瞳。术后将15只大鼠随机分为3组, 每组5只，分别为伤后1，3，7d 3个时相组，在各时间点裂隙灯显微镜观察晶状体混浊情况。
1.2.2免疫组织化学染色检测ILK在外伤性白内障中的表达 在伤后1，3，7d各时间点将大鼠颈椎脱臼致死, 并摘取双眼眼球,用40g/L 多聚甲醛固定眼球, 做眼球前矢状面石蜡切片(厚度为5μm) ,采用免疫组织化学方法测定晶状体上皮细胞(LE)中ILK的表达,光学显微镜观察拍照。以未行手术的对侧眼为对照眼，处理同上。空白对照不加一抗, 细胞质出现黄色、棕黄色颗粒着染为阳性, 未见上述颗粒着染者为阴性。
2结果
2.1鼠外伤性白内障模型的建立 术后用裂隙灯显微镜
图1 外伤性白内障模型图片 A：对照组晶状体透明, 未见明显混浊出现；B：晶状体在针头刺穿的部位出现局限性混浊；C：混浊范围扩大, 呈白色絮状；D：1d后囊完全混浊, 呈白色乳块状
图2 ILK在晶状体上皮细胞中的表达 A：对侧眼组各时间的晶状体上皮细胞胞质未见明显黄色、棕黄色颗粒着染；B：外伤后1d，晶状体前囊膜破裂处的晶状体上皮细胞还没有明显的增生迹象，但晶状体上皮细胞胞质中已出现ILK阳性表达的棕黄色颗粒着染；C：外伤后3d，前囊膜下上皮细胞增生，多层排列，阳性着染明显；D：外伤后7d，箭头1前囊膜下上皮细胞增生更加明显，箭头2后囊膜出现移行的上皮细胞，阳性着染强，箭头3和4炎症细胞阳性着染
观察大鼠外伤性白内障的形成状况。 术后1d 晶状体在针头刺穿的部位出现局限性混浊, 3d时混浊范围扩大, 呈白色絮状,5d 后完全混浊, 呈白色乳块状，此后白内障发展趋于稳定。对照组晶状体透明, 未见明显混浊出现(图1)。
2.2 ILK在晶状体上皮细胞中的表达状况 ILK在晶状体上皮细胞中的表达状况(图2)：对各组晶状体上皮细胞进行ILK的免疫组化染色显示，在外伤后1d，晶状体前囊膜破裂处的晶状体上皮细胞还没有明显的增生迹象，但晶状体上皮细胞胞质中已出现ILK阳性表达的棕黄色颗粒着染。外伤后3d，前囊膜下上皮细胞增生，多层排列，阳性着染明显。外伤后7d，前囊膜下上皮细胞增生更加明显，并向后囊膜延伸，后囊膜出现移行的上皮细胞，阳性着染强。对侧眼组各时间的晶状体上皮细胞胞浆未见明显黄色、棕黄色颗粒着染。
3讨论
整合素链激酶(ILK)是1996年Hannigan以β1整合素胞浆结构域为诱饵,运用酵母双杂交筛选系统在哺乳动物上皮细胞和肿瘤细胞的溶解物中发现的一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶[1]。 ILK存在于多种人类组织器官中,其激酶活性能被整合素与细胞外基质的结合迅速激活,也能被某个生长因子受体的酪氨酸激酶激活，并发挥其激酶活性,参与多种细胞的行为,ILK有着多种生物学功能。在跨膜信号传导中起着重要作用,从而调节着细胞的生长周期、细胞的黏附性、细胞的形状和迁移、细胞外基质的沉积等[2,3]。在生理状态下,机体组织细胞可有少量基础量ILK的分泌。病理状态下, ILK过度表达与上皮细胞发生的上皮间质化生(epithelial to mesenchymal transition EMT)密切相关,从而促进某些纤维化性疾病的发生发展[4]。TGFβ1及整合素是公认的上皮间质转化的最主要诱导因子,二者在这一过程中涉及到的细胞内信号传导通路虽各有不同,但ILK是 TGFβ1及整合素的共同下游因子[5,6],其在纤维化疾病中的重要性值得关注。
外伤性白内障是眼外伤的常见并发症。其病理表现既有晶状体蛋白的变性混浊，又有晶状体上皮细胞的过度增生和迁移。晶状体上皮细胞发生主动迁移实际上是细胞由上皮细胞向纤维细胞转化的一种表现，因为正常上皮细胞并没有迁移能力，只有在发生EMT时，细胞内部出现α平滑肌肌动蛋白（αSMA），细胞才可能迁移和收缩。因此外伤性白内障和后发性白内障一样，在某种程度上可以理解为是由于晶状体囊膜打开，炎性因子刺激晶状体上皮细胞增生，转化，迁移以至收缩的膜性纤维化疾病。而在临床上，也可以观察到一些病史较长的外伤性白内障患者，晶状体障质实际已经吸收，视力不好源于晶状体部位的纤维增殖膜遮挡。
本试验建立了大鼠外伤性白内障动物模型。在外伤后的第1d，晶状体上皮细胞的增生尚不明显，第3d时，前囊膜下上皮细胞增生，呈多层排列，而在第7d时，前囊膜下上皮细胞增生更加明显，并向后囊膜延伸，后囊膜出现移行的上皮细胞，细胞的形态已发生变化。目前尚没有研究完全确定在外伤状态下，晶状体上皮细胞内部到底有哪些信号分子激活，从而导致细胞的这些异常行为（过度增生，迁移和转化）。但本研究通过对ILK的染色检测发现，从外伤后尚无细胞增生的第1d，到出现明显增生的第3d，以及到细胞发生明显迁移的第7d，ILK在晶状体上皮细胞内部均呈较强的阳性表达，这提示ILK涉及到晶状体上皮细胞异常行为的多个环节。由于晶状体上皮细胞的这些异常行为不仅发生在外伤性白内障，也在与之有相同病理基础的后发性白内障中发生，因此对ILK的抑制可能成为外伤性白内障和后发性白内障防治的新靶点。
【参考文献】
1 Hannigan GE, Leung Hagesteijn C, Fitz Gibbon L. Regulation of cell adhesion and anchoragedependent growth by a newβ1integrinlinked protein kinase. Nature 1996;379:91
2谢婷,邹丽,整合素连接激酶及磷脂酰肌醇3激酶在子痫前期胎盘中的表达,华中医学杂志2007;31（6）：451462
3李菁菁,温进坤,韩梅.FAK和ILK介导骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移.中国生物化学与分子生物学报2006;22(6):477483
4 Li Y, Yang J, Dai C. Role for integrinlinked kinase inmediating tubular epithelial tomesenchymal transition and renal interstitia fibrogenesis. J Clin Invest 2003;112(4):503516
5陈秋,张京,敖绪军.整合素连接激酶在人肾间质纤维化组织中的表达及意义.第三军医大学学报 2005;22:7275
6 Somasiri A, Howarth A, Goswami D, et al. Overexpression of the integrinlinked kinase mesenchymally transforms mammary epithelial cells. J |
