作者：胡子龙，柳 林
作者单位：中国上海市第二军医大学长海医院眼科
【摘要】 目的:检测RF/6A细胞在不同氧浓度下缺氧诱导因子1α(hypoxiainducible factor1α, HIF1α)的表达以及活性氧水平，并探讨之间差异的意义。 方法:将RF/6A细胞置于常氧210mL/L O2、低氧10mL/L O2以及高氧950mL/L O2条件下，同时添加活性氧处理组，即细胞滴加3g/L过氧化氢1.5mL后放置常氧条件下。4组各孵育3h，取出后利用免疫组织化学方法检测其HIF1α表达，使用活性氧检测试剂盒观察活性氧水平。 结果:高氧组、低氧组以及活性氧处理组HIF1α表达水平明显高于常氧组(P<0.01)，高氧组、活性氧组活性氧水平均高于常氧组及低氧组(P<0.01)。结论:高氧条件下HIF1α表达增多，推测与活性氧稳定HIF 1α相关。
【关键词】 缺氧诱导因子1α；活性氧；低氧；高氧
Investigation on the expression of HIF 1α and the level of reactive oxygen species when RF/6A cell grows in different oxygen concentration
ZiLong Hu, Lin Liu
Department of Ophthalmology, Changhai Hospital of the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Correspondence to:Lin Liu. Department of Ophthalmology, Changhai Hospital of the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China. [email protected]
Received:2008 0718 Accepted:200810 07
Abstract
AIM: To investigate the expression of hypoxiainducible factor 1α (HIF1α) and the level of reactive oxygen species (ROS) when the RF/6A cells grow in different oxygen concentration, and to assess the difference and significance between these groups.
METHODS:RF/6A cells were exposed to nomoxia(210mL/L O2), hypoxia (10mL/L O2), hyperoxia (950mL/L O2) environment for a duration of 3 hours and divided into 3 groups and ROS group (adding 3g/L H2O2 into cells before exposed to nomoxia environment). The expression of HIF1α was detected by immunohistochemical method. The level of ROS was detected by Reactive Oxygen Species Assay Kit.
RESULTS: The expression of HIF1α in low oxygen group, hyperoxia group and ROS group was significantly higher than that in nomoxia group. The level of ROS in hyperoxia and ROS group was correspondingly higher than that in nomoxia and low oxygen group.
CONCLUSION: The expression of HIF1α rises in the hyperoxia environment for the reason that ROS increases the stability of HIF1α.
KEYWORDS: hypoxiainducible factor1α; reactive oxygen species; low oxygen; hyperoxia
Hu ZL, Liu L. Investigation on the expression of HIF 1α and the level of reactive oxygen species when RF/6A cells grow in different oxygen concentration. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi)2008; 8(11):22242227
0引言
眼球新生血管发生是导致视力下降甚至失明的重要原因。糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性以及早产儿视网膜病都会引起视网膜的新生血管，继而导致视力障碍。大量文献表明，视网膜组织缺血缺氧，缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor1α, HIF1α)蛋白降解减少，上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达是新生血管发生的基础[1]。因此，HIF1α与氧浓度关系密切。虽然动物实验中通过高浓度氧处理后诱导视网膜新生血管模型已经普遍应用， HIF1α与高浓度氧的直接关系却未明确。有文献报道高浓度氧条件下视网膜组织凋亡，视网膜血管阻塞，VEGF受体下调，从而促血管生成因子与抗血管生成因子平衡破坏[2 4]。该平衡被破坏，导致新生血管的产生[5]。同时，高浓度氧产生过多的活性氧，诱导细胞凋亡[6,7]。我们将视网膜血管内皮细胞置于不同氧浓度环境下检测缺氧诱导因子1α表达及活性氧水平，探讨氧浓度，活性氧和HIF1α三者之间的相互联系。
1材料和方法
1.1材料 恒河猴视网膜/脉络膜内皮细胞RF/6A细胞株为ATCC产品，购自上海肯强公司。RPMI1640细胞培养液、胎牛血清和胰酶均为GIBCO产品，购自上海普飞公司。兔多克隆抗体为SANTA CRUZ产品，购自上海优宁维公司(工作浓度1∶200)。SP试剂盒及DABH2O2显色试剂盒为中杉产品，购自小包装抗体网。将RF/6A细胞
图1SP法免疫化学染色 RF/6A细胞HIF1α的表达（×200） A:低氧；B：常氧；C：高氧；D：活性氧
置于37℃，50g/L CO2，饱和湿度的CO2培养箱内，培养基为含100mL/L胎牛血清、10mmoL/L HEPES液的RPMI 1640培养液。待3～4次传代，细胞生长稳定后。将细胞消化，分别接种于放入盖玻片的6孔板内，预先在CO2培养箱内培养至细胞贴壁并长满盖玻片面积的80%后分组。分组为低氧组、常氧组、高氧组和活性氧处理组，低氧组将细胞置于10mL/L O2，50mL/L CO2，940mL/L N2的厌氧培养箱内，常氧组细胞置于CO2培养箱内，高氧组细胞置于950mL/L O2，50mL/L CO2的高氧动物舱内(实验前予以紫外灯照射6h，进气口处接驳湿化瓶。使舱内无污染，湿度饱和，达到培养细胞的基本条件)，活性氧处理组六孔板孔内各滴加3mL/L过氧化氢1.5mL，使其在细胞液中最终浓度达到1.5mL/L。滴加过氧化氢后，置于CO2培养箱内。低氧组及高氧组气压均控制在0.1MPa(约一个标准大气压)。
1.2方法 各组细胞培养3h后，取出盖玻片。PBS洗3次，40mL/L多聚甲醛室温固定30min，30mL/L过氧化氢浸泡5min，丙酮通透4min(20℃)，其间分别PBS洗3次。滴加封闭血清20min后加入兔抗HIF1α多克隆抗体，37℃湿盒孵育1h。PBS洗后SP法免疫化学染色。DAB显色10～15min，光镜下观察，照相。使用活性氧检测试剂盒(reactive oxygen species assay kit, ROSAK)检测各组活性氧水平，该试剂盒利用荧光探针二氯二氢荧光素双乙酸盐(2,7dichlorofluo rescin diacetate,DCFHDA)进行活性氧检测。DCFH DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH而不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的2,7二氯二氢荧光素(DCF)。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。将探针用无血清培养基以1∶1000比例稀释，于分组前各6孔板每孔加入1mL。施加处理因素后，置于荧光显微镜下，以484nm蓝光激发，观察并照相。
统计学处理：每组实验重复5次，采用统计分析软件SPSS 16.0进行统计分析，对各组进行χ2及SNK检验。
2结果
2.1免疫组织化学结果 随机选择5个200倍镜视野进行判断，细胞质着色成棕黄色为阳性表现，HIF1α的表达以染色强度和阳性细胞率的得分之和进行判断：无染色0分，弱染色(浅黄色)1分，中等染色(棕黄色)2分，强染色(黄褐色)3分；阳性细胞率<5%0分，5%～25%1分，26%～50%2分，>50%3分。上述两项得分相加，0分为阴性()，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为中等阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。结果可见低氧组、高氧组及活性氧组HIF1α表达明显，棕黄色着色主要沉着于细胞胞浆，高氧组细胞胞核也可见着色(图1)。经统计分析示低氧组、高氧组及活性氧组HIF1α表达明显高于常氧组(P<0.01)且前三组之间无明显统计学差异(表1)。
2.2活性氧测定结果 低氧组、常氧组未见明显荧光，高氧组及活性氧组胞质荧光显色明显(图2)。经统计学分析，高氧组与活性氧组、低氧组与常氧组活性氧水平无明显差，其余各组间均有统计学差异(P<0.01,表2)。
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