作者：刘凯，包翠芬，刘 丹
作者单位：1中国辽宁省锦州市，辽宁医学院附属第一医院眼科；2中国辽宁省锦州市，辽宁医学院科学实验中心
【关键词】 成年 大鼠 视网膜 石蜡切片
0引言
大鼠是常用的实验动物，其视网膜对光敏感，常作为眼底疾病方面研究的实验动物。眼球构造复杂，各部分组织的软硬度悬殊，且各层间连接性差，液体不易渗透致使制作切片难度较高。一般常规方法较难制作出结构完整的眼球病理切片，进而对组织病理学诊断造成很大影响。目前国内外所使用的方法条件各异，但多存在制片周期长、材料要求特殊以及部分方法所需的试剂毒性较大等一些缺点，且取得的结果多数不满意。我们参考文献报告的方法[1 4]，结合实际情况，经过摸索成功地制作了大鼠视网膜的切片，现将我们的方法介绍如下。
1实验资料
SD大鼠100g/L水合氯醛按3mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于鼠板，大鼠头部抬高约1cm。分离双侧颈动脉，单侧结扎，对侧近心端结扎，由远心端插管，40g/L多聚甲醛溶液灌流固定，灌注瓶高100cm，开放后肢大静脉，待有淡红血水流出开始计时30min。灌流固定结束后立即将大鼠翻转，摘取眼球，放入20倍体积多聚甲醛固定液中，4℃保存24h。 脱水浸蜡:将眼球自固定液中取出，室温下流水冲洗2h；双蒸水浸泡3次，每次10min，此时用锋利刀片切掉角膜。750mL/L酒精过夜；800mL/L酒精2min；950mL/L酒精I 10min；950mL/L酒精II 10min（撕去虹膜，摘除晶状体）；1000mL/L酒精I 10min；1000mL/L酒精II 10min；二甲苯I 5min；二甲苯II 5min； 65℃下浸蜡2次，每次40min。浸蜡后的眼球,水平切面朝向包埋盒底，用58～60℃硬蜡包埋，常温条件下自然冷却，室温保存待切。切片及染色：用轮转式切片机连续切片，厚度4μm，51℃摊片，捞片，70℃烤片30min。常规HE染色、中性树胶封片。结果如图1，视网膜各层结构完整，排列规则。
2讨论
制备眼球组织学切片，较早的方法是火棉胶包埋，但火棉胶包埋法因脱水，浸胶的过程长，且切片一般较石蜡切片厚，效果不尽满意。因此，现已很少应用此方法制片。眼球常规方法固定和包埋因容易发生组织收缩、眼球变形、组织层间脱离、卷折及切片出现裂隙等原因，严重影响结果的获得。近年来，在该组织制片上改进的方法很多，但多存在步骤繁琐，材料要求特殊，固定液成分复杂，部分试剂毒性较大及操作时间较长等诸多不足。
本法采用易配制的40g/L多聚甲醛溶液进行固定，针对眼球壁不容易渗透特点，预先应用了灌流固定，经灌流后，眼球组织内血液基本被置换出，且眼球内存留的多聚甲醛溶液起到从内部固定的作用，较以往采用眼球壁开窗或注射的方法更有效地保护了眼球内组织，之后的浸泡固定法进一步加强了固定作用，经灌流固定后，眼球能够稳定地保持其球形状态，且经酒精梯度脱水后不发生眼球塌陷，因而发生视网膜脱离等几率也很小。固定后的眼球需经过水洗以除去固定液，进入700mL/L酒精之前要除去角膜，以利酒精溶液渗透，并为之后的处置做好准备。另外在浸蜡过程中，保证迅速、准确的操作是十分关键的。经该法制作的眼球标本，并没出现以往报道的视网膜严重收缩或卷曲，而且视神经及睫状体的部位切片也可取得。综上所述，我们认为本法有如下优点：(1)本法采用的试剂均为实验室常备试剂，费用较低。(2)全部操作时程短，尽量采用容易掌握的常规操作步骤，且具体操作时间集中，省时省力。(3)组织基本不变形，视网膜脱离率很低。 (4)组织处理过程中采用试剂较少，废液无需特殊处理。(5)经本法制作的视网膜切片不但可应用于HE染色，且多聚甲醛对固定蛋白固定效果较佳，还可应用于酶组织与免疫组织化学染色。
【参考文献】
1郭瑶,陈蕾,王敏芳,等.孟加拉玫瑰红诱导的激光所致大鼠缺血性视神经病变模型制作.国际眼科杂志 2007;7(3):703706
2刘正国,赵跃武,孔令非,等.六种单固定液对动物眼球标本影响的比较.眼科研究2002;20(5):443
3胡宏慧,曹晖.大鼠眼球标本石蜡制片方法的探讨.眼科新进展2001;21(6):403
4袁源智,袁非,黎蕾,等.基质细胞衍生因子1在Wistar大鼠视网膜上的生理性表达.眼科研究 2007;25(7):518521 |
