作者：杨荻 张美霞 张军军 严 密
作者单位：(610041)中国四川省成都市,四川大学华西医院眼科
【摘要】 目的：探讨血管生成抑制因子内皮抑素（endostatin, ES）对培养的血管内皮细胞增殖的影响，以获得最佳作用浓度、作用时间及最佳条件。 方法：将培养ECV304细胞分别培养在含倍比稀释的ES培养液中，其中培养液分为有无血清和VEGF无血清组，在不同的作用时间（24,48h及72h），应用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法测定ES对ECV304细胞增殖的影响。 结果：ES可显著抑制各种条件下ECV304细胞的增殖，以无血清条件下抑制作用达到最大，ES作用于ECV304细胞的最佳作用敏感时间区为24～48h，最佳作用浓度敏感区为157～2500mg/L。结论：ES对各种条件下ECV304细胞增殖有明显抑制作用，但未发现诱导内皮细胞凋亡。
【关键词】 血管生成抑制剂 内皮抑素 细胞培养 血管内皮生长因子
0引言
内皮抑素（endostatin, ES）是OReilly等在1997年从鼠血管内皮细胞瘤（EOMA）中分离和提纯出来的一种多肽[1]，分子量为20kDa，经氨基酸序列分析提示，ES为胶原纤维ⅩⅧ型C－末端非胶原区（NC）的184个氨基酸片断（132～315），许多研究表明ES通过特异性抑制血管内皮细胞的增殖达到抑制新生血管生成的目的。本研究主要应用不同浓度的ES作用于不同条件下的ECV304内皮细胞，MTT法测定ES对血管内皮细胞增殖抑制作用，以获得最佳作用浓度、最佳作用时间及最佳作用条件，为下一步应用于体内实验研究作基础。
1材料和方法
1.1材料 细胞：人脐静脉内皮细胞株ECV304由中科院上海细胞库提供。主要生化试剂：ES 购自美国Calbiochem公司，内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor, ECGF)购自德国Roche公司，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）购自美国Sigma公司，甲基噻唑基四唑（MTT）购自美国Sigma公司，兔抗人Ⅷ因子抗体由深圳晶美公司提供。
1.2方法
1.2.1血管内皮细胞ECV304的复苏、培养、传代及鉴定将ECV304细胞的冻存液在37℃水浴锅内快速融化，1000r/min离心15min，弃上清，沉淀细胞用培养液重悬并轻轻吹打混匀，形成细胞悬液，而后接种于培养瓶中，置入恒温CO2培养箱（50mL/L CO2，37℃）孵育。第2d换液，以后每2～3d换液一次。待细胞长至融合状态时，细胞用PBS清洗两遍，然后加入1.25g/L胰蛋白酶1～2mL，在倒置显微镜下观察，待细胞间隙增大，细胞回缩变圆时，立即将胰蛋白酶倒掉，加入培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打瓶壁细胞，使大部分细胞脱落形成细胞悬液；倒置显微镜下计数，以1.0×105/mL密度接种于新的培养瓶，恒温培养箱培养。细胞鉴定：培养细胞经950mL/L甲醇固定30min后，0.01mmol/L PBS冲洗3min，室温下3mL/L甲醇/H2O2处理5min，1g/L胰蛋白酶消化5min，PBS洗3min，加入兔抗人Ⅷ因子抗体（1∶200），4℃过夜，PBS洗3min，加入生物素标记的羊抗兔IgG（1∶200），37℃孵育50min，PBS洗3min，DAB呈色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察，拍照。
1.2.2实验分组 （1）有血清组：取同代对数生长期细胞，用PBS清洗，加入1.25g/L胰蛋白酶消化，倒掉后，用PBS反复冲洗吹打瓶壁，形成细胞悬液，倒置显微镜下计数，稀释成2.5×103密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养8h后弃培养液，各孔加入含100mL/L血清的无糖RPMI 1640培养液，实验组分别加入含有不同浓度ES（mg/L） 10000,5000,2500,1250,625,313,157的有血清培养液补足200μL，对照组不加ES，加入同等体积的有血清培养液，空白组不加ECV304细胞及ES，加入同等体积的PBS代替。培养24,48,72h后，每孔加入灭菌的PBS液配制的5mg/mL MTT溶液20μL，在细胞培养箱内孵育4h后，终止培养，小心吸出上清液，每孔加DMSO 150μL，振荡10min，使紫色结晶彻底溶解。在酶标仪上测定490nm处的吸光度（A）值，记录数据进行处理。A值与活细胞成正相关。实验结果以A值及细胞增殖抑制率I＝（A对照A实验）/A对照表示，重复三次在恒温CO2培养箱孵育24h。（2）无血清组：实验组和对照组的培养液中均不含血清，其余同（1）。（3）含VEGF的无血清组：实验组和对照组分别加入含VEGF 100mg/L的无血清培养液，其余实验步骤同（1）。
统计学处理：测量到的A值采用方差分析和组间t检验，数据处理由统计学分析软件SPSS 10.0完成，P<0.05代表差异有统计学意义。
2结果
2.1血管内皮细胞的复苏、培养、传代及鉴定 成功复苏的ECV304细胞在培养瓶中贴壁生长，呈扁平的短梭形，多角形单层镶嵌排列（图1）。Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色：内皮细胞核周、胞浆呈黄色的阳性反应，证实为血管内皮细胞（图2）。
[1] [2] 下一页 |
