作者：郑玉萍 佘华宁 冯朝晖 张璐琰 王肖华 熊全臣
作者单位：（710004）中国陕西省西安市，西安交通大学第二医院眼科
【摘要】 目的：观察神经短肽NAP对小鼠Müller细胞在缺氧环境中的保护作用。 方法：用重组腺相关病毒作为载体，将含NT4NAP融合基因的rAAVNAP和含报告基因的rAAVGFP对体外培养的小鼠Müller细胞进行感染，用MTT法和流式细胞仪检测感染细胞和未感染细胞在缺氧24h时的增殖活性和凋亡率。结果：感染rAAVGFP 的小鼠Müller细胞表达出明显的绿色荧光，缺氧24h时，感染rAAVNAP的细胞与未感染细胞相比，增殖活性高(A=0.109,P<0.05)，两组细胞凋亡率分别为8.13%和18.72%，感染有NAP细胞的凋亡率显著低于正常细胞（P<0.05)。 结论：神经短肽NAP可以减轻缺氧对Müller的损害。
【关键词】 神经短肽 NAP 缺氧 Müller细胞
0引言
Müller细胞是脊椎动物视网膜内最主要的神经胶质细胞，在视网膜的发育和功能活动中有着重要的作用［1］。近年来发现在糖尿病早期血管病变发生之前，视网膜Müller细胞的超微结构和生理功能就已发生变化［2］，因而研究Müller细胞在缺氧环境中的变化及保护十分重要。NAP(NAPVSIPQ)是一种强有力神经保护短肽［3,4］，我们用重组腺相关病毒作为载体，将NT4NAP融合基因对体外培养的小鼠Müller细胞进行转染，探讨NAP在缺氧环境中对Müller细胞的保护作用。
1材料和方法
1.1材料 出生后2wk的C578L/6N小鼠,由本校实验动物中心提供。低糖型DMEM培养液（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone 公司）,兔抗鼠GFAP多克隆抗体（博奥森公司），羊抗兔IgGTR（博奥森公司）,CoCl2(Sigma公司)。 构建融合基因所需质粒载体pGEMTeasy/NT4、原核表达质粒pBV 220 (西安华广生物工程有限公司提供);构建重组腺相关病毒所需骨架质粒pSSV 9in t和pAAV/A d:AAV包装辅助质粒(美国匹司堡大学生物实验室构建,第四军医大学基础部病理教研室张桐博士惠赠);pACCMVpLPA重组腺病毒质粒、pFG140辅助病毒质粒(西安华广生物工程有限公司提供);pGFP N 2质粒(Cloning Tech公司提供);人胚胎肾293包装细胞(美国ATCC公司产品,西安华广生物公司复苏传代);限制性内切酶EcoR I(167mkat/L)、Bam H I (233mkat/L)、T4DNA 连接酶(50mkat/L)(华美生物工程公司提供);Klenow酶(167mkat/L)(上海生工生物工程公司提供)。取出生2wk的C578L/6N小鼠,浸泡于体积分数为750mL/L的乙醇中处死后,在无菌状态下挖出眼球,去除球周筋膜组织,将取出的眼球浸泡在含有10mg/L庆大霉素的DMEM中3h,PBS冲洗后再将眼球浸泡于含有1g/L胰酶和1167mkat/L胶原酶的DMEM中，37℃保持60min。取出视网膜，细心吹打为
图1 A：相差显微镜下可见原代培养的Müller细胞大部分扁平，小、呈上皮样细胞生长接近融合，少量细胞形态不规则，似纤维样细胞（bar=50μm）；B：GFAP染色阳性率为100%（bar=50μm）；C：rAAVGFP 转染5d阳性表达率60%左右（bar=50μm）小片状，然后用低糖的DMEM培养（100mL/L FBS）。接种浓度为60mmol/L的培养皿中，有16个视网膜。5～6d后广泛冲洗，只有牢固贴壁的扁平细胞保留下来。3次/wk换液直到融合。细胞用GFAP染色鉴定。小片状视网膜在接种后 24h贴壁并有细胞爬出，随时间延长爬出的细胞增多并增殖活跃，在接种后第5d进行第1次换液，将漂浮的和贴壁差的细胞洗掉，剩下的细胞多数为Müller细胞，可能混杂神经元和其他细胞，原代细胞一般 7～10d即可长满，按照1∶2方式传代，传代后细胞周期缩短为 5～7d，经过 2～3次传代后可获纯度相对较高的 Müller细胞（图1A）。Müller细胞进行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体荧光染色阳性（图1B）。
1.2方法 NT4NAP融合基因、rAAVGFP 和rAAVNAP的构建见参考文献［5］。取生长至90% 融合的第1代传代鼠Müller细胞, 按照常规细胞传代培养将细胞分种至６孔培养板, 细胞接种密度为1×109/L, 每个培养皿接种5mL。常规细胞贴壁培养3d后按MOI为50分别进行rAAVGFP和rAAVNAP感染。GFP作为报告基因，荧光显微镜(Olympus) 下观察Müller细胞的GFP表达情况。缺氧模型的制作参照文献[6],将CoCl2(氯化钴)用去离子水溶解,配成200μmol/L的溶液,经过滤除菌后4℃备用。细胞分为以下4组: (1)对照组：细胞未经任何处理;(2)NAP转染组：细胞被转染rAAVNAP;(3)缺氧组：细胞经200μmol /L CoCl2处理24h;(4)NAP转染＋缺氧组：转染有rAAVNAP的细胞经200μmol/L CoCl2处理24h。
1.2.1 MTT检测各组细胞活性 以胰蛋白酶消化已融合的 Müller细胞和NAP转基因细胞，用含100mL/L FBS的 DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔约1×104个细胞接种于 96孔培养板中，每孔体积 200μL。置于50mL/L CO2孵箱中培养 24h后取出，换以含终浓度 200μmol/L CoCl2的培养基，37℃继续孵育，24h后每孔加入 MTT(5g/L)20μL，37℃继续孵育 4h，终止培养，小心吸弃孔内培养液。每孔加入DMSO 150μL，振荡 10min。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔A(absorbance)值，记录结果。空白孔为不加细胞只加培养液。对照组是未经任何处理的 Müller细胞。
1.2.2 Annexin V/PI法流式细胞术检测各组细胞凋亡率 以上各组细胞接种于 24孔板，每组做 3个复孔，缺氧处理24h后将各组细胞 1000r/min离心，10min，用冷 PBS洗涤2次，以 1×109/mL的浓度在结合缓冲液中重悬。室温下取100μL的细胞（每组做3个复管），加入FITCAnnexin V5μL和PI染料5μL，轻轻振荡、混匀，避光
图2 各组的吸光度A值（aP<0.05 vs缺氧组）
室温下孵育15min。加入染色缓冲液400μL，立即上流式细胞仪分析。
统计学处理：实验数据记录为平均数±标准差，组间用 SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析。
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