作者：卢艳 张婧 孙异临 王 蓉 李 林
作者单位：（100053）中国北京市，首都医科大学宣武医院1眼科；4神经生物学实验室；5药理实验室;2（100062）中国北京市普仁医院眼科；3（100050）中国北京市，北京天坛医院电镜室
【摘要】 目的：观察糖尿病大鼠早期视神经轴突纤维形态和数量变化以及脑源性神经营养因子（brainderived neurotrophic factor, BDNF）对糖尿病视神经的保护作用。
方法：雄性Wistar大鼠腹腔注射STZ建立糖尿病模型,模型建立2wk后开始玻璃体腔注射BDNF，1mo后灌注处死大鼠，取眼球及球后视神经6～8mm，电镜方法包埋，制作半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜观察视神经形态，同时图像分析和轴突纤维计数。
结果：糖尿病组与对照组相比，视神经轴突排列紊乱，数量明显减少，间质增多，BDNF治疗组与糖尿病组相比形态和数量有明显改善；轴突数量和神经纤维密度3组之间两两比较均有显著差异(P<0.01)。
结论：糖尿病大鼠早期视神经纤维结构明显损害，数量明显减少，BDNF对糖尿病性视神经损害有保护作用。
【关键词】 糖尿病视网膜病 视神经 脑源性神经营养因子 大鼠 电镜
0引言
传统理论认为糖尿病视网膜病（diabetic retinopathy, DR）属于微血管改变，但实际上它也是视网膜的一种神经变性疾病。研究发现糖尿病早期，血管并发症出现之前，视网膜神经细胞的分子结构和功能已经发生改变;大量研究表明BDNF在视网膜生理和病理生理过程中有重要作用，本文主要观察糖尿病大鼠视神经轴突纤维的损害以及玻璃体腔注射BDNF后视神经纤维数的变化，旨在初步探讨DR的发病机制和BDNF对糖尿病视神经病的作用。
1材料和方法
1.1材料 首都医科大学动物实验室提供体质量200g 左右雄性Wistar 大鼠30只,数字表法随机分组,正常对照组10只，糖尿病组10只，BDNF治疗组10只，分笼饲养，标准颗粒饲料，不限喝水。饲养场所通风良好，室温18～25℃，
图1 视神经光镜结果 A:正常组；B：糖尿病组；C：治疗组
表1 3组视神经纤维密度，数量，平均光密度比较（±s）
组别神经纤维密度（×3个/μm2）神经纤维数量(×106)神经细胞平均光密度值正常对照组10.2±1.816.7±2.90.86±0.06糖尿病组3.9±0.7b6.1±0.86b0.86±0.12BDNF治疗组5.2±0.9b11.6±1.4b0.81±0.13
bP<0.01 vs正常对照组
相对湿度40%～70%，12h 光照昼夜循环。实验前禁食12h,自由饮水。链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司。BDNF 冻干粉，美国Upstate 公司。牛血清白蛋白（BSA），美国Sigma公司。平衡盐溶液（BSS），美国Alcon公司。
1.2方法
1.2.1模型制备 （1）糖尿病模型：链脲佐菌素(STZ),临用前溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH4.5) ,配成浓度 10g/L 的溶液, 60mg/kg 腹腔注射。24,48,72h,1wk后分别剪尾采血,血糖仪测血糖,尿糖试纸测尿糖浓度,血糖浓度达16.7mmol/L,尿糖达+++～++++即为模型建立成功。正常对照组腹腔注射 0.1mol/L 柠檬酸缓冲液。以后每周和处死大鼠前各测血糖、尿糖1 次。（2）治疗组模型（BDNF 眼内注射）：STZ 腹腔注射 2wk 后，成模大鼠玻璃体腔注射BDNF，注射1次/wk，共2次。BDNF 冻干粉0.5g/L 溶于含1g/L BSA的平衡盐溶液中。100mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射，利多卡因表面麻醉成功后，随机选取大鼠一侧眼球，沿鼻上侧角膜缘剪开球结膜约3mm，用微量进样器取上述溶液 4μL 注射入大鼠眼玻璃体腔内，金霉素涂患眼。对侧眼内注射等量含1g/L BSA的平衡盐溶液。出现玻璃体出血或眼球萎缩者剔除。
1.2.2取材与电镜 糖尿病动物模型建立 1mo, 40g/L多聚甲醛心脏灌注处死大鼠，断头，于头顶正中切开暴露脑组织并将其完整去除，显露视交叉及视神经，沿视神经走行分离至球后，紧贴眼球将8～10mm长的视神经完整取下，去除周围筋膜及脂肪组织，于40g/L多聚甲醛后固定24h，置于30g/L戊二醛磷酸盐缓冲液中4℃冰箱保存。保存的标本用浓度为18mol/L蔗糖缓冲液100mL冲洗，10g/L四氧化锇磷酸盐缓冲液再次冲洗后固定，梯度丙酮溶液依次脱水，1kg/L丙酮/混合包埋剂（1∶1）浸透，Epon812包埋，超薄切片机切取1μm半薄横截切片，10g/L甲苯胺蓝染色，自来水冲洗，照相，保存.切片自然晾干，香柏油封片保存。
1.2.3计算机图像分析 (1)神经横截面分析视场选取方法：在100倍镜下作视神经横截面的十字形分割线，然后在200倍镜下以纵向定位线中点为中心由上向下连续选取3个方形视场，每个视场面积为12271.45μm2（图像分析仪固定数值）。（2）视神经轴突计数：首先作图像分割，选取神经纤维光密度值（DPI）在0.80～1.0范围内的神经纤维，计算机自动图像分析系统自动校正放大率。神经纤维密度的计算：将图像分析仪数好的神经纤维数文件导入Excel表格，此点数除以视场面积即为神经纤维密度，单位:个/μm2。
统计学处理：全部数据应用SPSS 11.5软件包进行处理，对实验数据求均数及标准差，各组数据之间分别进行单因素方差分析,对于方差不齐的组分别进行配对t检验和t′检验。
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