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2结果
2.1 NAP转染率 GFP作为报告基因来显示NAP的转染率，rAAVGFP 感染后, Müller细胞生长正常。感染2d后, Müller细胞开始出现GFP 表达, 在荧光显微镜490nm波长激发光下呈绿色, 第5d时GFP阳性表达的细胞约有60%(图1C)。
2.2 NAP在缺氧环境下对Müller细胞活性的影响 NAP转基因细胞在正常环境下的增殖活力比对照组的细胞略差，提示病毒转染对细胞的活性有一定的损伤。小鼠 Müller细胞在缺氧24h时细胞活性出现了明显的降低，但在这种缺氧环境中，NAP转基因细胞的增殖活性与对照组相比，没有显著差异，提示NAP在缺氧环境中对小鼠 Müller的增殖活性具有保护作用(图2)。
2.3 NAP在缺氧环境下对Müller细胞凋亡的影响 Annexin V/PI法凋亡双标检测图中，右下象限 AnnexinVFITC染色阳性、PI阴性细胞为早期凋亡细胞；右上象限 AnnexinVFITC、PI染色双阳性细胞为晚期凋亡及坏死细胞；左下象限 AnnexinFITC、PI染色双阴性细胞为活细胞；左上象限仅 PI染色阳性为处理时损伤的细胞。对照组凋亡细胞的百分比率为2.05%;在缺氧24h后，Müller细胞的凋亡率明显升高，为18.72%;NAP转染组与正常组相比细胞凋亡率有轻微升高，为4.63%,但是在缺氧环境下，转染了NAP的细胞与未转染的细胞相比，凋亡率明显降低，为8.13%。显示出NAP可以有效遏制由于缺氧导致的细胞凋亡。
3讨论
小鼠Müller细胞由于体积过小，取材困难，有关小鼠Müller细胞培养的报道不多。但是对于视网膜疾病的研究，有色鼠因为结构健全，优于常用的SD大鼠。C578L小鼠是视网膜变性rd小鼠的正常对照鼠，因而对这类小鼠视网膜细胞的成功培养，有助于后期体内的连续性研究。小鼠Müller细胞的培养首先要注意小鼠年龄的选择，最好是出生后1～2wk的乳鼠，此时视网膜细胞已经分化成熟，增殖活力较强。其次是Müller细胞的分离和纯化，将摘除的眼球于4℃浸泡在含有10mg/L庆大霉素的DMEM中3～6h，会显著降低视网膜神经元细胞的活力，但时间不宜过长，否则Müller细胞的活力也会受到影响。将眼球再次浸泡于含有1g/L胰酶和1167mkat/L胶原酶的DMEM中1h后从赤道部切开眼球，此时玻璃体液化，视网膜神经上皮也与其下的色素上皮自动分离，将分离到的视网膜神经细胞培养并传代后，便可得到较纯的Müller细胞。作为重要的神经辅助修复细胞，Müller细胞比神经元细胞更能耐受缺血缺氧的打击［7］。但是通过电生理检测早期糖尿患者发现Müller细胞的功能下降［2］，而离体研究也证实：Müller细胞缺氧12～16h时便可出现明显的细胞肿胀，活性降低等现象［8］。在本研究中，我们检测了缺氧24h的数据，显示出在这个时间点，Müller细胞增殖活性降低，凋亡率升高，表明缺氧对Müller细胞本身的损伤是不可忽略的。
NAP具有强大的神经元保护作用，它在109摩尔级便可延长鼠视网膜神经节细胞的存活时间和轴突的长度［9］。但NAP是1个只有8 个氨基酸的神经短肽, 缺少分泌表达元件, 需体外合成, 而且体内半衰期短, 因此靠外源性的药物添加来检验其功效和进行临床应用几乎是不可行的。我们在前期的研究中将NT4的信号肽与前导序列和NAPcDNA用NT4DNA 连接酶连接, 构建的融合基因NT 4NAP，成功解决了这一难题［5］。NT4 前导序列中的信号肽有助于将表达的神经保护短肽NAP分泌至真核细胞外。在本研究设立的缺氧环境中，转染了NT 4NAP融合基因的Müller细胞与未转染的细胞相比，增殖活性得到保存，凋亡率也明显降低，表明NAP可以拮抗缺氧导致的Müler细胞功能损害。NAP对Müller细胞的保护不仅在于Müller细胞本身，这一结果预示着Müller细胞可能作为NAP的载体细胞发挥更强大的神经修复功能。
【参考文献】
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4 Romano J, Beni A, Dani L, et al. A single administration of the peptide NA P induces longterm protective changes against the consequences of head injury: gene atlas array analysis. J Mol Neuro Sci 2002;18(122):3745
5佘华宁, 郑玉萍,孙乃学，等.神经短肽NAP 对体外培养的兔视网膜神经细胞的作用.四川大学学报医学版 2007;38(3):382385
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7 Li Q, Puro DG. DiabetesInduced Dysfunction of the Glutamate transporter in retinal Müller Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002;43(9):31093116
8刘晓娟,惠延年,郭斌,等.缺氧下外源性血管内皮生长因子对体外大鼠Müller细胞的影响.国际眼科杂志 2007;7(2):395 399
9 Lagreze WA, Pielen A, Steingart R, et al. The peptides ADNF9 and NA P increase survival and neurite outgrowth of rat retinal ganglion cells in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005;46(3):933938 上一页 [1] [2] |
