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2.2细胞形态学变化 在相差倒置显微镜下观察ES作用24，48，72h后ECV304活细胞的形态无明显变化，未见细胞变圆及细胞脱壁悬浮。仅见视野中细胞数目较对照组减少，增殖减慢。
2.3 ES对血管内皮细胞增殖的影响
2.3.1不同浓度的对培养的ECV304细胞的抑制增殖作用 从表13中可以看出，有血清组、无血清组及VEGF+无血清组分别加入ES（157，313，625，1250，2500，5000，10000mg/L）作用后对ECV304细胞均有明显抑制增殖作用，并呈浓度依赖性，ES浓度在157～2500mg/L时，I值变化最明显，说明此段浓度为敏感区，浓度达到2500mg/L抑制效果达到最佳，高于此浓度后抑制作用基本进入平台期，增加ES浓度，增殖抑制率未见明显增加。通过统计学分析，有血清组、无血清组和VEGF+无血清组ES抑制增殖作用均较对照组有显著差异，P<0.05。
2.3.2 ES作用不同时间对培养的ECV304细胞的抑制增殖作用 从表13中可以看出， 0～48h之间I值变化最明显，此段为作用时间敏感区，48h时三组ES作用达到最强，其中以无血清条件下抑制增殖率达到最大值为55.43％，随着时间的延长，三组并未见抑制增殖率的显著增强。
图1正常培养的ECV304细胞（×100）
图2Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色（×100）
2.3.3 VEGF对ECV304细胞的促增殖作用 VEGF+无血清组与无血清组中对照组相比较，100mg/L的VEGF可显著促进ECV304细胞的增殖，二者经统计学比较差异具有显著性，P<0.05。
3讨论
抗血管生成治疗的目的在于减少新生血管的发生或降低其生长速度，使其对机体的危害大大降低，治疗目的主要是达到细胞抑制而不是细胞毒效应。抗血管生成药物众多，目前最为瞩目的是ES，是已鉴定出的血管生成直接抑制药物，并可重复给药并且无耐药性。本实验应用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞作为实验对象，加入ES作用后，MTT法测定增殖抑制率，结果表明ES可显著抑制各种条件下ECV304细胞的增殖，以无血清条件下抑制作用达到最大，ES作用于ECV304细胞的最佳作用敏感时间区为24～48h，最佳作用浓度敏感区为157～2500mg/L。VEGF被认为是在生理和病理的血管生成中必不可少的重要诱导因子，可刺激血管内皮细胞的有丝分裂、迁徙，增加血管的通透性、诱导毛细血管的形成，抑制VEGF的作用成为治疗新生血管的潜在途径。本实验应用VEGF诱导血管内皮细胞增殖，用不同浓度的ES作用于内皮细胞，结果表明ES可以在不同时段都可抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖，与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。
ES抑制血管内皮细胞增殖的作用机制目前尚未明了，最新研究进展认为内皮细胞将内皮抑素内吞后，使接头蛋白Shb磷酸化，形成一种125kDa的具有酪氨酸激酶活性的复合物，引起内皮细胞G1期阻滞、凋亡，抑制新生血管的形成[2]。也有研究认为内皮抑素可以与金属蛋白酶前体蛋白（ProMatrix Metalloproteinase）形成稳定的复合体，阻止基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）的激活[3]，MMP为中性内肽酶，可单独或者与其他酶一起降解细胞外基质成分，使血管内皮细胞增殖、迁移，抑制其 表1有血清组ES对ECV304细胞的作用A值及I值表2无血清组ES对ECV304细胞的抑制作用A值及I值表3VEGF+无血清组ES对ECV304细胞的抑制作用A值及I值各组组内均有P<0.05 vs对照组
激活可以抑制血管生成；另有研究表明内皮抑素可诱导内皮细胞产生凋亡，从而抑制内皮细胞的生长，但是也有研究表明未见有细胞凋亡的出现[4]。本实验应用不同浓度的ES对血管内皮细胞进行增殖抑制，从形态学上未见细胞形态发生明显改变，也未见凋亡小体等凋亡细胞特征性表现，因此认为ES对血管内皮细胞的作用仅限于抑制增殖，并没有诱导内皮细胞凋亡。
【参考文献】
1 OReilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell1997;88:277285
2 DexelIus J, Larsson H, Sasaki T, et al. Endostatininduced tyrosine kinase signaling through the Shb adaptor protein regulates endothelial cell apoptosis. Blood2000;95(11):34033411
3 Kim YM, Jang JW, Lee OH, et al. Endotatin inhibits endothelial and tumor cellular invasion by blocking the activation and catalytic activity of matrix metalloproteinase. Cancer Res2000;60(19):54105413
4 Shichiri M, Hirata Y. Antiangiogenesis signals by endostatin. FASEB J2001;15:10441053 上一页 [1] [2] |
