作者：燕建军 彭辉灿 王俞方 吴橙香 刘照耀
作者单位：1(421001)中国湖南省衡阳市，南华大学附属第二医院眼科；2（412012）中国湖南省株州市，湖南中医药高等专科学校
【摘要】 目的：研究不同浓度的银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,GBE)对体外培养的高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells，HRCECs)增殖和凋亡的影响。
方法：体外培养从角膜移植术后新鲜人眼球提取的HRCECs。取生长良好的第3～4代细胞用于实验，实验分为低糖对照组、高糖对照组、高糖+不同浓度GBE组，用噻唑蓝（MTT）比色法检测HRCECs的增殖。吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)荧光双染色、流式细胞术检测HRCECs的凋亡率，并在荧光显微镜下观察荧光染色后HRCECs凋亡形态学改变。
结果：MTT比色法结果显示：用12.5，25.0，50.0，100.0mg/L的GBE处理高糖环境下HRCECs，作用24，48，72h，高糖+不同浓度GBE组与高糖对照组相比具有显著性差异（P＜0.05），高糖+不同浓度GBE组之间两两比较均具有显著性差异（P＜0.05）。AO/EB荧光染色法、流式细胞术检测细胞凋亡率显示：高糖+不同浓度GBE组与高糖对照组比较均有显著性差异（P＜0.05），高糖对照组显著高于低糖对照组（P＜0.05）。荧光显微镜下观察到活细胞，早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞，非凋亡的死亡细胞生物学形态改变的特征。
结论：GBE促进高糖环境下HRCECs的增殖，抑制其凋亡。
【关键词】 人视网膜微血管内皮细胞 增殖 凋亡
0引言
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是眼科主要致盲眼病之一。目前其发病机制并不清楚，无特效的治疗方法，预防DR的形成至关重要。高血糖是DR发病的中心环节，研究表明高糖诱导血管内皮细胞凋亡，并抑制其增殖。GBE的主要药效成分是黄酮类和内酯类，具有强大的清除自由基，抗氧化作用，研究证实GBE具有保护血管内皮细胞的功能。Fitzl等[1]亦发现GBE具有抑制DR发展的作用。本研究通过GBE作用于体外培养的高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells，HRCECs)增殖和凋亡的影响,观察GBE对其增殖、凋亡的影响。
1材料和方法
1.1材料 20g/L胰蛋白酶( sigma )、胎牛血清(杭州四季青公司)、DMEM培养液(武汉博士德)、银杏叶提取物(GBE)（德国施瓦舒培博士药厂）、培养瓶、培养皿、眼科器械、第Ⅷ因子相关抗原抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)、丫啶橙(AO) (Sigma)、溴乙啶(EB) (Sigma)。
1.2方法
1.2.1人视网膜微血管内皮细胞培养 取材于手术室角膜移植术后新鲜人眼球,参考国内外文献[2,3]的培养方法进行人视网膜血管内皮细胞原代培养。将培养瓶置于50mL/L CO2 , 37℃培养箱内，每2d换液1/3～1/2,待细胞长满瓶底约80%，按1∶2传代。
1.2.2人视网膜微血管内皮细胞鉴定 用相差显微镜观察细胞的生物学形态特征；将盖玻片放入6孔板内,细胞爬片后，运用免疫细胞化学方法检测第Ⅷ因子相关抗原抗体,显微镜下观察其表达。
1.2.3实验分组和药物浓度 实验分为0组：不加细胞只加培养基的调零组;G0组：高糖对照组; G1组:高糖+12.5mg/L GBE组;G2组：高糖+25.0mg/L GBE组;G3组:高糖+50.0mg/L GBE组;G4组：高糖+100.0mg/L GBE组;GL组：低糖对照组.分别观察GBE作用后24，48，72h。高糖的葡萄糖浓度为25mmol/L，低糖为5.5mmol/L。
1.2.4 MTT测HRCECs增殖 取生长良好的第3～4代细胞用于实验。弃培养基，PBS洗2次，2.5g/L胰酶消化，加含200mL/L胎牛血清高糖或低糖DMEM培养液，分别制成高糖和低糖细胞悬液，调整细胞浓度为6×104个/mL,加入96孔板中，高糖共5组，低糖1组，以及调零组1组，每组8个复孔，每孔180μL。将96孔板置于50mL/L CO2，37℃培养箱内，24h待细胞贴壁后G1～G4组分别加20μL不同浓度GBE，使GBE终浓度为12.5，25.0，50.0，100.0mg/L。每2d换液1次，并同时加入GBE，保持各组药物终浓度不变。分别孵育24，48，72h后，每孔加入20μL 5g/L MTT,孵育4h，弃培养基，用滤纸吸干水分，加DMSO，振荡10min，用自动酶标仪570nm波长测吸光度A值。上述条件下重复实验3次。增殖率＝(实验组吸光度值对照组吸光度值）/对照组吸光度值。
1.2.5 AO/EB荧光双染色在荧光显微镜下观察HRCECs凋亡形态学改变并计算凋亡率 取第3～4代生长良好的细胞，弃原培养基，PBS洗2次，2.5g/L胰酶消化，加含200mL/L胎牛血清高糖或低糖DMEM培养液，分别制成高糖和低糖细胞悬液，调整细胞浓度为6×107个/mL,接种于25cm2 培养瓶，每瓶4.5mL,置于50mL/L CO2 , 37℃培养箱内，培养24h待细胞贴壁后，G1～G4组分别加0.5mL不同浓度GBE，使GBE终浓度为12.5，25.0，50.0，100.0mg/L。每2d换液1次，并同时加入GBE，保持各组GBE终浓度不变。孵育72h后，收集细胞，制成浓度约1010个/L活细胞悬液。取100μL活细胞悬液，加入100mg/L AO与100mg/L EB等量混匀后的混合液5μL，混匀，吸混合液一滴于干净载玻片上，盖玻片封片，立即在荧光显微镜下观察细胞形态改变。并在20min内由4人在不同视野分别计数200个细胞，计算其凋亡率。在荧光显微镜下可见活细胞(VN) ,早期凋亡细胞(VA),非凋亡的死亡细胞(NVN),晚期凋亡细胞(NVA),细胞凋亡率由以下公式计算: 凋亡率=(VA+NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)×100%。
2.6流式细胞术检测细胞凋亡率 取第3～4代生长良好的细胞用于实验，按AO/EB染色相同方法培养细胞，GBE药物干预，孵育72min后，收集细胞，离心，弃上清，在沉积的内皮细胞中加入4℃预冷的700mL/L乙醇5.0mL混匀，置于冰箱（4℃）固定24h，离心，弃乙醇，用PBS 洗3次，调整细胞浓度为109个/L，取1mL PBS细胞悬液加入RNase A（终浓度为50mg/L），37℃消化30min，加入碘化丙锭（终浓度为50mg/L），混匀，4℃避光染色60min，100目尼龙网筛过滤，上流式细胞仪检测不同DNA含量的细胞分布。实验结果计算机分析处理得出凋亡的百分率。
统计学处理；采用SPSS 13.0 软件进行统计分析，结果以±s表示，多组均数比较用单因素方差分析，两两组间均数比较采用LSDt检验。
2结果
2.1 HRCECs的培养与鉴定 在倒置相差显微镜下观察细胞形态：细胞呈现铺路石样单层贴壁生长。运用免疫细胞化学方法鉴定：经第Ⅷ因子相关抗原抗体染色，HRCECs胞浆中有棕色着色，阴性对照组无着色。均证实体外成功培养出HRCECs。
2.2 MTT检测GBE对HRCECs增殖的影响 药物作用24，48，72h，实验组各浓度GBE对HRCECs增殖有显著影响，并存在时间和浓度的依赖性（P＜0.05，表1）。
2.3 AO/EB染色检测GBE对HRCECs凋亡的影响 收集细胞，GBE处理后，培养72h,G1～G4组HRCECs凋亡率有明显差异（P＜0.05，表2）。荧光共焦显微镜下观察：活细胞(VN)核染色质着绿色并呈正常细胞结构；早期凋亡细胞(VA)胞质着绿色略带红，核染成红色，细胞形态接近正常；晚期凋亡细胞(NVA)核染色质着桔红色，核皱缩或碎裂；非凋亡的死亡细胞(NVN)核染色质着桔红色，结构大致正常。
2.4流式细胞术测HRCECs细胞凋亡率 应用ModifitL TL .1.00(MAC) 分析系统进行数据处理,低于G1 期的细胞(亚G1 期) 为凋亡细胞,其占细胞总数的比例为凋亡 表1 GBE对HRCECs增殖的作用表2 AO/EB染色检测HRCEC凋亡率( 表3 流式细胞术测HRCECs细胞凋亡率率。统计分析表明各实验组HRCECs凋亡率存在显著性差异（P＜0.05，表3）
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