作者：李东侃 黄维艺 张 悦 侯家敏
作者单位：（361001）中国福建省厦门市，厦门大学附属厦门眼科中心
【摘要】 目的：体外培养表达人β神经生长因子基因（βnerve growth factor, βNGF）的工程化猫角膜内皮细胞，为进一步猫角膜内皮细胞的移植做准备。
方法：将人βNGF重组真核表达载体pcDNA4βNGF，通过EffecteneTM脂质体介导转染到体外培养的猫角膜内皮细胞中，选择性培养基筛选转基因后细胞，人NGF单克隆抗体行细胞免疫组织化学染色（immunohistochemistry）。
结果：选择性培养基培养2wk后筛选出独立细胞克隆，该细胞高表达人βNGF基因。
结论：转基因方法可体外培养出表达人βNGF基因的工程化猫角膜内皮细胞。
【关键词】 人βNGF 转基因 角膜内皮细胞
0引言
成年后的人和灵长类动物的角膜内皮细胞具有潜在的分裂再生能力和生理功能代偿能力[1,2]，我们利用转基因方法将人βNGF转入体外培养的猫角膜内皮细胞中，进一步促进细胞分裂并筛选出稳定表达外源基因的工程化细胞，为进一步猫角膜内皮细胞的移植做好准备。
1材料和方法
1.1材料 实验动物为生后6wk 10只健康家猫，体质量在150～200g之间，雌雄不限。主要试剂EffecteneTM转染试剂盒购自荷兰 QIAGEN公司； RPMI1640培养液干粉购自promega公司；胎牛血清购自杭州四季青生物制品有限公司；神经特异稀醇化酶抗体（neurone specific enolase, NSE）、神经生长因子抗体（NGF）及免疫组织化学SP试剂盒购自北京中山生物制品公司；G418购自美国GIBCO公司。pcDNA4βNGF质粒由李东侃提供[3]。
1.2方法
1.2.1猫角膜内皮细胞的体外培养[4] 采用组织块法简便、快捷培养出原代、纯净的猫角膜内皮细胞单层后，行NSE免疫组织化学染色及透射电镜观察来进一步鉴定细胞类型及纯度。1代猫角膜内皮细胞80%融合后传代于60mm2培养瓶中，每瓶种植细胞数5×105，24h细胞达60%融合，备用。
1.2.2猫角膜内皮细胞G418最小致死剂量测定 每孔1×104接种细胞于24孔板中培养至50%融合，加不同浓度的G418培养液，浓度梯度：0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45， 0.50， 0.55， 0.60， 0.65g/L。3d更换一次培养液，2wk左右根据细胞的死亡情况确定细胞G418最小致死剂量。
1.2.3 EffecteneTM脂质体介导βNGF转染猫角膜内皮细胞并行转染效率检测 紫外分光光度仪检测质粒DNA纯度，计算pcDNA4质粒、pcDNA4βNGF重组质粒及报道基因pcDNA4LacZ浓度，统一转染时用量。报道基因的转染在24孔板中进行。
1.2.4抗性细胞克隆的筛选 转基因后细胞以1∶5传代于6孔板中，继续培养48h，更换选择性培养液筛选培养，同时未经任何处理的猫角膜内皮细胞作对照，每3d换培养液1次，2wk后含0.1g/L G418的培养液维持筛选，继续培养。
1.2.5人βNGF单克隆抗体SP免疫组织化学染色 待细胞抗性克隆逐渐增大后于显微镜下观察克隆位置并标记，无菌镊夹取沾有2.5g/L胰蛋白酶的无菌滤纸片，将其置于所标记克隆处10s，并于已事先装有维持筛选培养液的24孔板中涮数次，直至粘附的细胞脱下为止，弃滤纸继续培养、传代。行人βNGF单克隆抗体免疫组织化学染色。
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