作者：曲利军 金迪 齐艳华 林 辉 苏 红 贾红艳
作者单位：1（150086）中国黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第二医院眼科；2（266071）中国山东省青岛市，青岛大学；3（150001）中国黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学第一临床医学院眼科医院
【摘要】 目的：研究高浓度葡萄糖诱导人LECs凋亡以及胰岛素对LECs凋亡的影响。方法：采用终浓度为5.56，11.11和22.22mmol/L葡萄糖处理体外培养的LECs，诱导建立LECs凋亡模型。用终浓度为11.00μU/mL的胰岛素进行干预。利用Giemsa染色法、流式细胞仪和透射电镜对LECs凋亡情况进行检测。结果：Giemsa染色和透射电镜发现了凋亡的LECs。流式细胞仪检测发现随着葡萄糖浓度增高，LECs凋亡百分率亦呈升高趋势，不同组间差异有显著性。通过胰岛素干预可降低由高糖引起的LECs凋亡百分率。 结论：高浓度葡萄糖可在体外诱导兔LECs凋亡。胰岛素可保护LECs并减少其凋亡的发生。
【关键词】 凋亡 晶状体上皮细胞 高糖 胰岛素
0引言
白内障是糖尿病破坏视力最常见的并发症之一，有关糖尿病性白内障的发生机制和预防，国内外学者做了大量研究。Takamura等[1]报导在糖尿病大鼠白内障模型的LECs中出现凋亡并据此推测高糖可能引起LECs凋亡。本文以LECs体外培养为基础，通过施加诱导因素（高浓度葡萄糖）和保护因素（胰岛素）来观察LECs凋亡率的改变，探讨糖尿病性白内障的病因及治疗。
1材料和方法
1.1材料 试剂：美国GIBco BRL公司的DMEM培养基，制成含200mL/L胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、10万U/L青霉素G和 80mg/L链霉素培养液；实验室自制Giemsa染液；AnnexinvFITC凋亡检测试剂盒；诺和灵R（丹麦NovoNordisk公司）。仪器：美国BectonDickinson公司FACSort型流式细胞仪；日本OLYPUS公司AU2700型全自动生化分析仪；EMM型倒置相差显微镜和C35OLYMPUS型照相机；日本电子公司(JEOL)JEM1220型透射电子显微镜；37℃ 50mL/L CO2培养箱。人LECs系（HLEB3）：由哈尔滨医科大学组织工程与发育生物学研究中心提供。其他实验试剂和仪器由哈尔滨医科大学病原生物学（BSL3）重点实验室提供。
1.2方法
1.2.1细胞培养 细胞培养于200mL/L胎牛血清的DMEM中，置于37℃ 50mL/L CO2培养箱中培养并进行传代、消化、种瓶、换液。将对数生长期的LECs悬液调整细胞密度为5×104/L接种于96孔无菌培养板中，每孔200μL。
1.2.2 LECs细胞诱导凋亡模型的建立 （1）模型的制作：设立空白对照组（I组），然后通过全自动生化分析仪将培养液葡萄糖终浓度分别调定成5.56 mmol/L组（II组）、11.11mmol/L组（III组）和22.22mmol/L组（IV组）。设定诱导时间为12，24和36h。（2）凋亡的评价：Giemsa染色法进行凋亡初筛；流式细胞仪测定LECs凋亡百分率；透射电镜观察凋亡LECs超微结构改变。选取诱导凋亡模型最满意的一组进行后续实验。
1.2.3胰岛素“治疗”实验 （1）胰岛素干预：选取诱导凋亡模型中的一组进行胰岛素干预实验。施加胰岛素（用全自动生化分析仪将培养液胰岛素终浓度调定成11.00μU/mL）组作为干预组，未施加胰岛素组作为空白对照组。作用时间分别为12，24和36h。（2）效果评价：流式细胞仪测定LECs凋亡百分率，步骤同前。
统计学处理：所有实验结果采用±s表示，所得数据进行方差分析和t检验，以P＜0.05为显著性标准。
2结果
2.1 LECs凋亡的诱导 （1）Giemsa染色后镜下见：LECs呈上皮细胞样外观，细胞核染成蓝紫色，细胞浆染成粉红色，凋亡细胞的细胞核固缩、浓聚或断裂形成许多核片段，呈致密紫蓝色大小不等的颗粒。（2）透射电子显微镜下可见凋亡LECs的超微结构：染色质固缩并凝结成块，聚集在核膜周边呈新月形，细胞浆浓缩，内质网变疏松并与胞膜融合，形成空泡，线粒体和高尔基体结构无明显改变。带有细胞器的凋亡小体正在形成（图1，2）。坏死细胞的染色质稀疏呈颗粒状，细胞浆肿胀，细胞器结构破坏，细胞膜不完整。（3）LECs凋亡百分率的流式细胞仪检测结果见表1。各组间进行t检验。实验数据表明，与相同作用时间II组比较，I组作用12，24和36h无显著意义；III组作用12h有显著意义（P＜0.05）；III组作用24h和IV组作用12h具有非常显著意义（P＜0.01）；III组作用36h和IV组作用24，36h具有极显著意义（P＜0.01）。由于III组（11.11mmol/L组）的LECs凋亡百分率较典型，并且其细胞坏死率也较低，故选其作为凋亡模型进行后续实验。
2.2胰岛素对高糖诱导凋亡LECs的保护作用 干预组与空白对照组的作用时间分别为12，24和36h。然后用流式细胞仪检测LECs凋亡百分率，结果见表2。各组间进行t检验。通过与相同作用时间的空白对照组比较发现，胰岛素干预组中的LECs凋亡百分率显著降低，说明胰岛素确实对LECs有保护作用，并且随着时间的延长，这种保护LECs抵抗高糖诱导凋亡的作用愈加明显。
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