作者：毕宏生 解孝锋 吴建峰 崔 彦 于同利
作者单位：（250002）中国山东省济南市，山东中医药大学眼科中心 山东施尔明眼科医院
【摘要】 目的：探讨茶多酚对高糖条件下大鼠晶状体上皮细胞线粒体活性氧的影响。
方法：体外培养大鼠晶状体上皮细胞，加入不同浓度的葡萄糖，加入不同浓度茶多酚进行干预，共聚焦显微镜检测各条件下大鼠晶状体上皮细胞线粒体活性氧量的变化，分析高糖及茶多酚干预对细胞线粒体活性氧表达的影响。
结果:培养基中葡萄糖两种浓度（L1和L2组）,大鼠晶状体上皮细胞（L）MTR、DCF荧光强度/μm2细胞面积L1组L2组比较，P＜0.05。在30mmol/L葡萄糖浓度培养基中加入0.1μmol/L和 0.3μmol/L浓度的茶多酚，大鼠晶状体上皮细胞死亡率CDR(%)及线粒体膜电位MMP(FI)L3组与L4组比较，P>0.05。L2组L3组及L2组与L4组比较P＜0.05。
结论：高糖条件下培养的大鼠晶状体上皮细胞线粒体活性氧产生增多，而应用茶多酚干预后细胞线粒体活性氧产生减少，细胞死亡率降低。
【关键词】 晶状体上皮细胞 茶多酚 激光扫描共聚焦显微镜 活性氧 线粒体
0引言
糖尿病引起的晶状体混浊是常见的慢性糖尿病并发症，氧化损伤已是糖尿病性白内障的病变机制之一，而线粒体活性氧（reactive oxygen species,ROS）的过量产生则是这一机制的中心环节[1]。使用强氧化剂茶多酚（tea polyphenols，TP）通过选择性培养基培养了大鼠晶状体上皮细胞，加入高浓度的葡萄糖，模拟体内高血糖条件，检测细胞线粒体活性氧量的变化，而后加入不同浓度的茶多酚干预进行后，再检测细胞线粒体活性氧量的变化，分析高糖及茶多酚对细胞线粒体活性氧的影响，为糖尿病性白内障的防治提供新的途径。
1材料和方法
1.1材料 相差倒置显微镜（Olympus,Japan）；超静工作台（Thermo,USA）；CO2培养箱（HEHER Hirasawa Workes）；数码相机（Nikon,Japan）。激光扫描共聚焦显微镜（CLSM，LEICA TCS SRE公司）DMEM培养基（Gibco公司）；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS， Maverick公司）；胰酶EDTA（Gibco公司）；茶多酚粉剂（TP,多酚含量99.99%，福州日冕科技开发有限公司生产）；线粒体标记荧光探针（MitoTracker Red CMH2Xros,MTR），二氯荧光素探针，（2’7’dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA）（Molecular Probes公司）。
1.2方法 大鼠晶状体上皮细胞的培养（细胞培养方法参照常规细胞培养方法[2]）随机选取正常健康雄性Wistar大鼠6只，断髓处死，立即完整取出双眼球，用9g/L生理盐水冲洗后置于BSS平衡盐溶液10min（含0.5ml/L庆大霉素）。然后在体式显微镜下用无菌手术快刀片从角膜中央划开，娩出晶状体，用显微镊和维纳剪将晶状体上附着的悬韧带及虹膜等周围组织剔除干净。在去除虹膜的过程中用无菌的BSS平衡盐溶液清洗晶状体，完整取下晶状体后，再用无菌的BSS平衡盐溶液冲洗晶状体表面，使其表面不附着任何异物。然后用显微无齿镊取下晶状体前囊膜和赤道部的晶状体囊膜，再次用无菌的BSS平衡盐溶液清洗囊膜表面，以免囊膜上黏附晶状体皮质影响培养效果。将囊膜剪成约1mm×1mm的数个小片，均匀分散于装有1mL低糖型DMEM培养液的培养皿中。盖好盖后将培养皿置于37℃、一定湿度、含950mL/L O2、50mL/L CO2的培养箱中，放置3～4h待组织贴壁后，在培养皿中小心加入低糖型DMEM培养液3mL淹没组织块，盖好盖后放入CO2的培养箱中培养。待上皮细胞开始生长后，继续培养2wk左右，至贴壁细胞占低面积80%以上后消化、传代，细胞传至第3代时。采用含100mL/L胎牛血清的培养基进行培养，培养基中葡萄糖浓度分别设定为5，30mmol/L两种浓度（L1和L2组）；在30mmol/L葡萄糖浓度培养的大鼠晶状体上皮细胞中加入茶多酚分别配成0.1μmol/L和 0.3μmol/L的茶多酚浓度培养（L3和L4组）。采用MTR和H2DCFDA对细胞进行双标记检测活性氧的产生并定位。MTR发射波长为608nmol/L，易于与525nmol/L的H2DCFDA氧化产物DCF绿色荧光区分开来，因此MTR适用于共聚焦显微镜的多重标记。荧光素通过LEICA TCS SRE激光扫描共聚焦显微镜观察。DCF的绿色荧光通过氩激光在488nmol/L激发，MTR通过氦/氖激光在543nmol/L激发。培养的上皮细胞长至80%汇合
表1大鼠晶状体上皮细胞（L）MTR、DCF荧光强度（±s/μm2细胞面积）
L1L2aL3L4MTR33.2±1.732.3±1.632.6±1.932.1±3.6DCF22.8±3.228.5±3.222.6±1.622.5±1.8
aP<0.05 vs L2，L3，L4后，移去培养液，PBS冲洗2遍，MTR、H2DCFDA加入培养基中配成装载液，使终浓度分别为200nmol/L和2μmol/L，置于37℃培养箱中孵育45min，移去装载液，PBS冲洗3遍，洗净染料，避光保存15min后取出盖玻片细胞面朝下置于载玻片上，碳酸缓冲液封片，共聚焦显微镜观察并照相记录。所获图像经背景校正后，通过LEICA公司提供的分析软件，计算每μm2细胞面积MTR、DCF的平均荧光强度。每种培养条件的细胞取4份样本，每份标本任选5个高倍镜视野。
统计学处理：采用SPSS 12.0统计软件对数据进行统计分析，对多组均数比较采用OneWay AVOVA，并通过StudentNewmanKeuls行多个样本均数间两两比较；对两组均数比较采用非配对t检验。
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