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2结果
大鼠晶状体上皮细胞传至第3代时，4组细胞已培养于不同条件的培养基中15～20d。L1，L2，L3，L4组大鼠晶状体上皮细胞加入MTR（200nmol/L）和H2DCFDA（2μmol/L）的装载液共同培养可以观察ROS的产生和线粒体的结构，当检测MTR红色荧光时，可以看到散在的亚细胞结构，即为线粒体。DCF荧光强度定量分析表明，高葡萄糖浓度培养的上皮细胞ROS的产生量增加，而茶多酚干预组的上皮细胞ROS的产生量较高糖的降低，且接近低糖组，两种茶多酚浓度组间无明显差异。与此相对应的，四种条件下上皮细胞MTR荧光强度无差异（表1）。为确定DCF荧光是否位于线粒体内，将两图像重叠后同时具有MTR和DCF两种荧光的区域就表现为黄色，从而证明线粒体为ROS产生的部位。在高糖浓度下，细胞内的黄色亚结构多于低糖浓度下的细胞，表明增加葡萄糖浓度后细胞产生的活性氧增多，并且来源于线粒体，而应用茶多酚干预后细胞内的黄色亚结构较高糖明显减少，表明茶多酚干预后细胞产生的活性氧减少（图1）。
3讨论
糖尿病引起的晶状体混浊是常见的慢性糖尿病并发症，但其机制尚不十分明确。实验研究发现，H2O2在糖尿病性白内障患者房水和晶状体内升高，干扰细胞结构蛋白质和高活性酶的DNA功能，致晶状体皮质混浊[3]。近年来开始用转基因技术探讨糖尿病性白内障多元醇通路与氧化应激的关系[4]，多元醇通路的AR使葡萄糖还原为山梨醇，消耗了还原型辅酶II ，致GSH下降、LPO及丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平升高；同时该通路中SD促山梨醇转化成果糖时也产生了氧化应激，导致葡萄糖大量汇集此通路。说明高糖导致的氧化损伤与晶状体抗氧化防御系统的紊乱在糖尿病性白内障发生和发展中起着重要作用。氧化损伤已是糖尿病性白内障的病变机制之一，而线粒体活性氧（reactive oxygen species,ROS）的过量产生则是这一机制的中心环节，阻断这一途径可以防止由高血
图1 大鼠晶状体上皮细胞荧光照片×200 A:为L1条件时MTR的荧光照片，其中红色荧光为细胞线粒体的部位;B：为L1条件时DCF的荧光照片，其中绿色荧光为细胞活性氧的部位;C：为A、B重叠的照片，其中黄色荧光为细胞线粒体活性氧的部位;D：为L 2条件时MTR的荧光照片，其中红色荧光为细胞线粒体的部位;E：为L 2条件时DCF的荧光照片，其中绿色荧光为细胞活性氧的部位;F：为D、E重叠的照片，其中黄色荧光为细胞线粒体活性氧的部位;G：为L3条件时MTR的荧光照片，其中红色荧光为细胞线粒体的部位;H：为L3条件时DCF的荧光照片，其中绿色荧光为细胞活性氧的部位;I：为G、H重叠的照片，其中黄色荧光为细胞线粒体活性氧的部位;J：为L4条件时MTR的荧光照片，其中红色荧光为细胞线粒体的部位;K：为L4条件时DCF的荧光照片，其中绿色荧光为细胞活性氧的部位;L：为J、K重叠的照片，其中黄色荧光为细胞线粒体活性氧的部位
糖诱导的PKC的激活、AGEs的形成、山梨醇及NFkappaB的激活[1]。晶状体上皮细胞是抗氧化损伤的活性中心，是高血糖损害的主要靶位。细胞线粒体活性氧的产生定位通过MTR和H2DCFDA双标记实现，MTR是一种亲脂的阳离子复合物，由于线粒体膜电位（外正内负）的存在，MTR积聚在线粒体而使其表现荧光。H2DCFDA可以通过细胞膜快速进入细胞，当细胞内存在ROS时，无荧光的H2DCFDA可以立即被氧化成具有荧光的DCF，其荧光强度与细胞内ROS生成量成正比，因此用于检测活性氧的产生。当MTR和DCF荧光重叠时将表现为黄色荧光。这样，黄色区域即为线粒体来源的活性氧。本研究表明，在高葡萄糖浓度条件下，晶状体上皮细胞出现形态和数量的异常改变，上皮细胞活性氧产生增多，并且活性氧通过MTR检测证明定位于线粒体，说明高糖可以诱导线粒体活性氧的产生增多，活性氧对细胞结构及功能有直接的损害作用，这种改变有可能是一种始动因素继而通过多种途径导致糖尿病性白内障的发生。因为有研究表明，过量产生的线粒体活性氧可以抑制磷酸甘油醛脱氢酶，导致磷酸丙糖水平升高，而磷酸丙糖破裂即为细胞内主要的糖基化终末产物[5]；磷酸甘油醛脱氢酶被抑制后，还可以导致磷酸二羟丙酮及6磷酸果糖水平的增加，前者可导致从头合成甘油二脂的增加而激活蛋白激酶C[6]，后者则可以增加己糖胺途径[1]。
茶多酚（tea polyphenols，TP）是绿茶的提取物，因含酚性羟基故极易发生氧化、聚合、缩合等变化，具有较好的抗氧、清除自由基的能力，且安全、无毒、用量少，其抗氧化作用的机制，其抗氧化能力是人工合成抗氧化剂BHT，BHA的4～6倍，是维生素E的6～7倍，是维生素C的5～10倍，国内外已有相关报道[7]。我们前期试验已证明茶多酚对轻度和中度大鼠糖尿病性白内障有明显的降低晶体混浊程度的作用，其作用机制可能与茶多酚直接清除活性氧自由基并激活细胞内抗氧化防御系统有关[8,9]。在加入茶多酚的高糖培养基中的上皮细胞中，线粒体活性氧的产生量明显减少，而且晶状体上皮细胞形态和数量的异常改变较少，保持了上皮细胞的原有特征，较低和较高的茶多酚浓度之间无明显差异，不呈剂量依赖关系。从而证明了茶多酚能减少晶状体上皮细胞活性氧产生，减少了线粒体活性氧对晶状体上皮细胞结构及功能有直接的损害作用，保持了晶状体上皮细胞的形态和功能的正常，为阻止和延缓糖尿病性白内障发生提供了新的思路，为近一步研究奠定了基础。
【参考文献】
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8毕宏生，李树杰，崔彦，等.茶多酚防治STZ诱导的大鼠糖尿病性白内障的机制.山东大学耳鼻喉眼学报2008；（22） 1：15
9郭勇,严宏,丁正华.糖尿病性白内障大鼠晶状体谷胱甘肽含量的变化.国际眼科杂志,2006;6(6):12751277 上一页 [1] [2] |
