|
2结果
2.1猫角膜内皮细胞G418最小致死剂量测定 在加入G418第2d，浓度为 0.65，0.6g/L的孔中出现细胞死亡脱落现象，存活细胞渐减少，待2wk时，G418浓度≥0.35g/L的孔中均无细胞生长。因此0.35g/L应为猫角膜内皮细胞Zeo基因的筛选浓度。
2.2抗性细胞克隆的形成 经G418选择性培养基筛选14d后，有明显细胞克隆形成（图1），克隆细胞中96.4％被β半乳糖苷酶染为淡蓝色。
2.3单克隆抗体的免疫组织化学染色结果 抗性细胞克隆经2.5g/L胰蛋白酶消化后继续培养，传三代后行人βNGF单克隆抗体免疫组织化学染色，正常体外培养的猫角膜内皮细胞均匀淡染，而G418筛选后所得抗性细胞克隆高表达人βNGF基因（图2）,透射电子显微镜下较多细胞见核分裂像（图3）。
3讨论
角膜内皮细胞体外培养证明了人及灵长类动物的角膜内皮细胞在特定的条件下可能存在一定的分裂再生能力和生理功能代偿能力[5,6]。为了赋予角膜内皮细胞更强的再生能力及抗排斥反应能力，Cho等[7]从眼库提供的96只不适合做为供体的角膜上分离出角膜内皮细胞，将编码SV40大、小T抗原的基因转入该细胞中，培养成为永生细胞，并种植于受体裸露的Descements膜上，培养7d后光学和电子显微镜下观察，见新的角膜内皮细胞呈类卵圆形外观，依连接复合体结合成多角形单位，仍由Na+K+ATP酶实现角膜内皮细胞中水的转运功能，使经历了24h液体灌注实验的角膜仍保持透明，说明这种新生角膜内皮细胞不仅具有天然角膜内皮细胞的形态也具有其泵功能[8]。将这种重新结合的角膜用于同源小鼠的穿透性角膜移植，6wk后角膜仍显示澄清外观。这种永生细胞为角膜内皮细胞的移植提供了无限供给细胞，同时也显示了角膜内皮细胞具有潜在的增殖能力。
探讨βNGF对角膜内皮细胞的可能作用，促进角膜内皮细胞分裂再生，在基因水平改变角膜内皮细胞的生物学活性，使之成为永生细胞，我们尝试利用转基因的方法，将人βNGF基因转入体外培养的与人角膜内皮细胞具有相似生物学性状的猫角膜内皮细胞中，细胞分裂再生能力提高[9]，利用G418选择性培养基筛选出了表达人βNGF基因的猫角膜内皮细胞克隆，但因EffecteneTM脂质体转染效率较低，很难长期稳定表达外源基因，这就需要选择更适合的转基因载体。同时活体眼是多组织构成的复杂功能器官，受多基因调控，达到高效、长期稳定表达外源基因，同时对活体眼不产生毒副作用是我们进一步研究的关键。
【参考文献】
1谢立信，李绍伟，董晓光,等.人各种角膜内皮核变化的初步观察.中华眼科杂志 1998；34（1）:1920
2唐娜，李辰，徐锦堂.灵长类动物角膜内皮细胞再生能力及方式的研究.中华眼科杂志 1998；34（1）:2829
3李东侃，宋跃，王传富 ，等.βNGF和NGF基因重组真核表达载体的构建.中国组织工程研究与临床康复2007；50（11）：1012110123
4李东侃,宋跃,王传富，等.猫角膜内皮细胞的快速体外培养及其鉴定.眼科研究2006;24（6）:581581
5 Harris DL, Joyce NC. Transforming growth factorbeta suppresses proliferation of rabbit corneal endothelial cells in vitro. Interferon Cytokine Res 1999；19:327334
6 Wilson SE,Lloyd SA,He YG, et al. Extended life of human corneal endothelial cells transfected with the SV40 large T antigen. Invest Ophthalmol Vis Sci 1993；34:21122123
7 Cho KS, Joo CK, Williams JS, et al. Stimulation of quiescent corneal endothelial cells by direct delivery of the SV40 large Tantigen protein. Curr Eye Res 2000 ；20(1):5863
8 Aboalchamat B, Engelmann K, Bohnke M, et al. Morphological and functional analysis of immortalized human corneal endothelial cells after transplantation. Exp Eye Res 1999；69(5):547553
9李东侃，宋跃，王传富 ，等.人β神经生长因子基因对体外培养猫角膜内皮细胞分裂再生作用的研究.中华眼科杂志 2008；44（4）: 337342 上一页 [1] [2] |
