作者：陈梅 邱晓星 彭清华 姚小磊 曾志成
作者单位：（410007）中国湖南省长沙市，湖南中医药大学第一附属医院眼科
【摘要】 目的：评价蛴螬提取物对有色家兔脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的抑制作用。方法：有色家兔40只，实验组32只，空白对照组8只。实验组兔通过倍频Nd:YAG激光(波长为532nm)眼底光凝方式建立CNV模型。光凝后立即随机分为4组，每组8只(16眼)，分别为实验对照组、维生素E治疗组、驻景丸加减方治疗组、蛴螬提取物治疗组。激光光凝后7，14，21，28d各组兔均行眼底照相观察、荧光素眼底血管造影(FFA)和光学相干断层扫描(OCT)检查。分别于光凝后14、28d两次处死，每次随机选取动物4只(8眼),检查完后空气注射处死动物摘取眼球后节行组织病理学检查，行VEGF和bFGF免疫组织化学分析,并行透射电镜观察，以评估蛴螬提取物对CNV的抑制效果。 结果：光凝后14d, 实验组CNV的生成率分别为47.9%、41.7%、43.3%和28.6%,经χ2检验,CNV生成率治疗组较对照组均降低(P<0.05),且蛴螬提取物组最低,与另外3组比较有统计学意义(P<0.05)。光凝后28d,光凝区纤维血管组织增生（FVP）厚度治疗组较对照组显著变薄（P<0.05）。且视网膜脉络膜巩膜切片新生血管定量分析及组织学切片,透射电镜观察结果显示实验治疗组CNV的生成与对照组相比均减少，差异有统计学意义(P<0.05)；且蛴螬提取物治疗组表达低于其他组，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论：蛴螬提取物可以抑制实验性CNV中VEGF和bFGF的表达，从而可以抑制实验性CNV的形成。
【关键词】 脉络膜新生血管 蛴螬提取物 血管内皮生长因子 碱性成纤维因子
0引言
脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)是多种病因导致的CNV芽穿越Bruch膜，并在视网膜色素上皮(retinal epithetlium, RPE)上或下增殖形成的纤维血管组织[1,2]。CNV的形成机制尚不十分清楚，研究发现多种生长因子参与CNV 形成的调控，其中与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生成因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）关系密切[3，4]。蛴螬是鞘翅目金龟子总科的幼虫的总称，具有破血、行瘀、散结、明目等作用，古书《神农本草经》、《晋书》都有治疗目疾的记载。我们通过倍频Nd:YAG激光诱导有色家兔脉络膜新生血管，给予蛴螬提取物干预CNV形成，探讨蛴螬提取物是否对CNV形成有抑制作用。
1 材料和方法
1.1材料 蛴螬中主要有效成分为氨基酸，因此，参照国内阳长明等[5]的提取方法设计蛴螬提取物制取方法:蛴螬1000g，清洗10遍，浸泡一晚，后洗至无臭味。加蒸馏水1000L，用370g/L HcL调pH值为2。用高压蒸汽锅(哈尔滨松花江医疗器械厂）蒸2h(压力0.15Mpa)。过滤后再用400g/L NaOH调pH值至6.5～6.8。冷却，隔水加热，浓缩至1000mL。40只（80眼）有色家兔(湖南中医药大学实验动物中心提供)，体质量2～2.5kg，不分雌雄，实验前双眼前节和眼底检查均正常。32只为实验组，8只（16眼）为A空白对照组。以5g/L美多丽P滴眼液双眼散瞳，100g/L水合氯醛3mg/kg行全麻后,在Goldmann三面镜下用倍频Nd:YAG激光(波长532nm)于视乳头下方作视网膜光凝。照射部位位于视乳头及髓线下方，以光凝后有气泡产生为击破Bruch膜的标志[6]，激光参数：功率350～375mW,爆光时间0.1s,光斑直径50μm，点数20～30。
1.2方法 光凝后立即将32只有色家兔随机分为4组，每组8只（16眼），分别为B实验对照组、C维生素E治疗组、D驻景丸加减方治疗组、E蛴螬提取物治疗组。由光凝后当天开始，至光凝后28d，每天分别以灌胃方式给予维生素E 0.1g/kg，驻景丸加减方（由湖南中医药大学第一附属医院药剂室提供）2g/kg，蛴螬提取物1.5mL/kg，实验对照组不做任何处理。空白对照组不行激光光凝和给药处理。光凝后24h；3，7，14，21，28d行眼底彩色照相（TRCNM6S无散瞳眼底照相机，日本）检查。有色家兔于光凝后7，14，21，28d行FFA检查。具体方法如下:将有色家兔散瞳,200g/L荧光素钠(0.1mL/kg)耳缘 iv后,立即开始摄影,持续约30min,记录荧光素渗漏情况。计算其渗漏率(荧光素渗漏率=荧光渗漏点数/所观察的激光斑点数×100%)。在 iv晚期,参照Takebana等[7]的方法将荧光素渗漏程度分为无渗漏(0级)、轻度渗漏(1级)、中度渗漏(2级)和重度渗漏(3级)4个级别。有色家兔于光凝后7，14，21，28d行光学相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)(ZEISS，德国)检查。激光造模后14，28d各组有色家兔随机取4只于耳缘 iv空气10mL处死动物，摘除眼球后,取眼后段固定于40mL/L多聚甲醛液中,石蜡包埋。5μm厚度切片行苏木精伊红染色,2μm厚度切片做免疫组织化学检测VEGF、bFGF表达。一抗为兔抗VEGF多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、FGF2兔多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司),二抗为生物素标记的IgG(武汉博士德生物工程有限公司),滴加SABC(武汉博士德生物工程有限公司),DAB显色,苏木素复染,二甲苯透明,封片。应用MIAS1000图像分析系统在400倍视野下,每张切片随机选取4个视野,对切片染色结果进行分析,计算平均灰度值变化的相关系数R。激光造模后28d，选取眼球后段激光光凝部位脉络膜视网膜2mm×5mm,按常规制成电镜标本，透射电镜下观察脉络膜视网膜各层的超微结构。
图1 光凝后14d,FFA检查 A：实验对照组；B:维生素E治疗组；C:驻景丸加减方治疗组；D:蛴螬提取物治疗组
统计学处理：应用SAS 9.0统计学软件包，对荧光素渗漏强度比较采用秩和检验。OCT表达的统计分析采用重复测量的方差分析，组间两两比较采用的是snkq检验。相同时间点各组VEGF和bFGF表达的统计分析采用方差分析和q检验;不同时间点同组的VEGF和bFGF表达统计分析采用成组设计的两样本均数比较的t检验;P<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1眼底彩照和FFA检查结果 眼底彩照光凝后24h四组均表现为视网膜水肿,光凝斑为淡灰白斑,17%～23%光斑区视网膜浅层出血、视网膜下出血,出血量少而局限；7d视网膜水肿减轻,出血点部分吸收；14d后4组有76%～85%光斑出血完全吸收,视网膜中度水肿,出血的光斑旁可见黄白色渗出；28d光斑出血完全吸收,未见视网膜水肿。光凝后7d时出现视网膜动脉前期点状荧光渗漏,晚期依然可见,但范围局限;光凝后14d,4组分别有47.9%、41.7%、43.3%和28.6%的光斑出现荧光渗漏,晚期呈现高荧光（图1A～D）;21d荧光渗漏的光斑数继续增加达到高峰,这时静脉期渗漏最明显,晚期继续扩大为边界清晰的高荧光区;光凝28d后光凝斑荧光素渗漏率无明显增加(表1)。表1 光凝后各组荧光素渗漏的光凝斑数目 表2 兔CNV形成过程中OCT图像中内层高反射层厚度
2.2 OCT检查结果 光凝后7d,4组家兔实验眼OCT均显示在损伤的中心区,高反射色素上皮层被破坏,脉络膜反射增强增厚,在其顶端可见点状红白色高反射区增厚,偶可见光斑处突出于视网膜的血肿呈低反射。光凝后14d,梭形或团块状红色高反射区域增加,光凝处未见低反射出血暗区,色素上皮部分萎缩。光凝后21d,梭形或团块状红色高反射区域进一步增加。光凝后28d,可见较大团块状、梭形红色高反射团块(表2，图2A～E)。
2.3组织学观察 HE染色:正常有色家兔视网膜脉络膜各层组织结构清晰、完整(图3A)。实验对照组光凝后14d视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)层、Bruch膜破裂、外核层缺损、内核层部分消失、脉络膜毛细血管层损伤、色素脱失,可见色素性巨噬细胞和迁移增殖的RPE细胞。并有毛细血管样物质突向视网膜下形成的CNV,可见新生血管的管腔(图3B);光凝后28d,新生血管膜形态和厚度基本稳定,其上的色素上皮修复接近完整。E组也有类似变化,但在光凝后早期炎症反应较轻,中性粒细胞和巨噬细胞出现较少,在晚期(14～21d后)视网膜色素上皮修复迅速,CNV的发展迟缓(图3C)。免疫组化染色:在正常对照组视网膜上有少量VEGF和bFGF的表达,光凝后14d，B组视网膜神经节细胞层、色素上皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞中VEGF和bFGF阳性表达增多(P<0.01),胞浆呈蓝色着染,E组VEGF和bFGF阳性表达为弱阳性，C,D组VEGF和bFGF染色阳性(图4,5);光凝后28d B组视网膜神经节细胞层出现强阳性染色(P<0.01),内核层也有着色, bFGF主要定位于光凝部位的RPE细胞的细胞浆中,VEGF主要定位于神经节细胞、内核层和血管内皮细胞,E组VEGF和bFGF阳性表达 表3 视网膜中VEGF及bFGF表达的图像分析
2.4电镜检查结果 正常空白组视网膜色素上皮细胞膜完整，胞质内线粒体呈椭圆形，结构完整，板层状嵴清晰可见，色素上皮细胞核的膜完整光滑，核内染色质分布比较均匀，玻璃膜完整，脉络膜血管内皮细胞核染色质分布均匀（图6A）。实验对照组视网膜色素上皮细胞膜不完整，胞浆内线粒体肿胀呈圆形，线粒体嵴变短或消失呈空泡样变性，可见视网膜下由纤维母细胞和血管内皮细胞围成的
图6 有色家兔光凝28d透射电镜下脉络膜新生血管的表达（TEM×7000） A：正常空白组；B：实验对照组；C：维生素E治疗组；D：驻景丸加减方治疗组；E：蛴螬提取物治疗组
新生血管，血管内皮细胞核圆，核膜完整，核内染色质聚集，分布欠均匀，周围纤维组织增生（图6B）。维生素E治疗组与实验对照组比较，新生血管减少，纤维组织增生，线粒体轻度肿胀（图6C）。驻景丸加减方治疗组线粒体轻度肿胀，血管较成熟（图6D）。蛴螬提取物治疗组线粒体结构比较完整，板层状嵴数量较多，排列较均匀整齐，可见闭塞的新生血管（图6E）。
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