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图 1 原代HRPE细胞（倒置显微镜×100） A：加250mL/L的VCM后，见有异倍体的RPE细胞生长,→:三核及多核细胞；B 未加VCM的HRPE细胞生长良好，核分裂相多见，→:双核分裂细胞
图 2 第2代HRPE细胞（倒置显微镜×200） A：加250mL/L VCM的HRPE细胞呈明显老化状态，细胞扁平，无色素，类似纤维细胞；B：未加VCM的HRPE细胞仍含有较多的色素颗粒，细胞呈六角形或梭形生长
3讨论
PVR的特征之一是RPE细胞的病理增生，其发生发展与RPE细胞增生的调控失常有关。在其发生中RPE与玻璃体的接触是前提条件，为此我们在体外培养的HRPE细胞中加入VCM，来模拟PVR这一病理过程，并研究在此过程中HRPE细胞形态，增殖活性及细胞周期的变化。我们将HRPE细胞分别培养在100，250，500，1 000mL/L VCM中,发现100，250及500mL/L VCM均能使HRPE细胞的增生活性增强，含1 000mL/L玻璃体的VCM则使HRPE细胞发生了凋亡。但在含250mL/L玻璃体的条件培养液中，HRPE细胞的生长活性及细胞周期的变化幅度是最明显的；100与500mL/L VCM对HRPE细胞的生长活性的影响间并不存在明显差异；我们认为上述结果的原因是在体外进行的细胞实验中培养液及血清对细胞生长状态的维持是必不可少的，玻璃体本身并不能维持细胞生存的需要，故1 000mL/L VCM组的HRPE细胞由于缺乏营养而发生了凋亡。而250mL/L VCM组与100mL/L及500mL/L VCM组间的差异提示玻璃体的体积过大或过小均不能使HRPE细胞的病理增生达到最旺盛的水平。这种生长特性也许是因为玻璃体与细胞培养液内的蛋白质，血清存在最适比例，二者在一定范围内存在着平衡，一旦这种平衡被不同程度的打破，细胞的生长状态就随之变化了。在本实验中打破这一平衡的前提条件是在培养液中存在的浓度为10mL/L的胎牛血清，因为Kirchhof等[8]认为，在不含血清的情况下玻璃体并不能使HRPE细胞出现细胞生长状态的改变，而在加入血清之后即使血清浓度低至1mL/L,VCM也能显著的刺激HRPE细胞的增生。我们实验中所选择的血清浓度为10mL/L，在此浓度下HRPE细胞仅能维持存活，并不发生显著细胞生长，也不能形成S形细胞生长曲线,从而排除了血清作为一种丝裂原的干扰。但由于有玻璃体的作用，HRPE细胞生长明显旺盛，提示玻璃体液中含有一些潜在的促增生因子, 它们需血清中某些成分的介导、激活或与其结合而发挥作用。
各种细胞的周期时间不同差异主要在于G1期的长短不同。在离体培养条件下可通过控制外在条件使细胞分裂减慢或停止，但无论采用什么手段均停顿在G1期。这表明细胞一旦通过G1期就注定要完成S,G2及M期。到目前为止，对于玻璃体液作用后HRPE细胞的细胞周期变化还未见报道，我们欣喜的发现HRPE细胞生长状态的改变与其的细胞周期相对应。我们发现，不同体积的VCM作用后细胞进入S期的比例明显增加，提示玻璃体是通过促进细胞进入S期，从而加速细胞分裂而使细胞生长旺盛的，而G2期的比例增加则是继发于S与G1期比例的变化。在人体正常细胞中, DNA是比较恒定的参量, DNA含量随着细胞增殖周期各时相而发生变化。当受到致癌因素刺激时,DNA损伤导致DNA质和量的异常,成为DNA非整倍体细胞,也称异倍体细胞[14]。肿瘤细胞由于调节与生长控制系统障碍而获得无限增殖能力,需要合成大量的核酸以满足其迅速生长的物质需要,故其DNA含量和倍体数有不同程度的改变，细胞的DNA非整倍体是恶性肿瘤的特征性标志之一。值得一提的是在我们的实验组中HRPE细胞有异倍体的出现，表明在我们模拟的PVR病理状态下，HRPE细胞的生长是非常活跃的。洪晶等[15]在外伤后发生PVR眼的原代HRPE细胞的培养中也发现了这种异倍体细胞，说明PVR这种增生性疾病中的关键细胞—HRPE细胞具有一定向肿瘤细胞转化的倾向。但与大部分肿瘤细胞60％～70％左右[16]的异倍体比例相比我们实验所得到的异倍体细胞比例还是相当小的。我们的实验组中异倍体含量也大大低于外伤眼中的20％[15]。认为这与我们试验所使用的诱导条件是有关的，因为我们用的健康人的玻璃体与发生血视网膜屏障严重破坏的外伤眼，视网膜脱离眼的玻璃体内蛋白成分存在差异[5，6]。遗憾的是因为流式细胞术所需的样本量较大，我们没有进行连续时间点的观测及比较。而且由于1 000mL/L VCM组需要在无血清的条件下培养至少48h，此时细胞大多凋亡，与我们所要进行的细胞增生周期分析无关，故未进行该组细胞周期的检测。
综上所述，我们将玻璃体液作用于HRPE细胞后，检测到了HRPE细胞行为学的改变。其生长状态、细胞周期的改变必然有其调控的上游分子信号的改变，究竟是何种信号蛋白参与了这种细胞生长活性改变的调节将是我们需要进一步研究的课题。
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