图2  内毒素时间-浓度曲线

    2.3  真菌标准株的结果  烟曲菌、串珠镰刀菌和茄病镰刀菌的浓度时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线与葡聚糖的相似。

    2.4  细菌标准株的结果  绿脓杆菌的浓度-时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线与内毒素的相似。金葡萄球菌不能做出浓度时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线。
   
    2.5  临床标本的检测  检测的19例临床标本，根据浓度时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线，其中11例为真菌感染，有8例为细菌曲线，由于所有标本真菌培养阳性，为真菌和细菌混合感染。
   
    3  讨论
   
    真菌性角膜炎是严重的致盲眼病，主要以镰刀菌、曲霉菌、假丝酵母菌等感染为主［1，2］，近年发病率不断增多，发现戴软镜者［3］和激光手术后患者也有发病［4］，此病由于难以确诊（真菌培养需10天）延误治疗，以至引起失明，甚至丧失眼球。人们寻找快速诊断真菌感染的方法，鲎血提取液中的G-因子，可被真菌细胞壁特有成分(1～>3) beta-D-glucan（葡聚糖）激活后经过显色或凝集反应进行检测，可做真菌的定性和定量试验，称为G因子法。
   
    动态浊度法已在2005版药典中用于对内毒素的测定［5］，它是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，我们用此方法分别测定内毒素标准品、葡聚糖标准品、真菌标准株及细菌标准株，并测定19例临床标本。临床标本是经培养确诊为真菌感染，根据我们实验的浓度时间曲线、时间反应曲线和时间速率曲线的形态，11例为真菌，8例为细菌的图形，可能为真菌和细菌的混合感染。8例不能确诊是由于鲎试剂中有G、B和C因子，B、C因子用于测定细菌，G因子用于测定真菌，细菌测定比真菌敏感，当两者混合时，只能测定出细菌。多粘菌素已用于抑制内毒素的凝集反应［6］，我们用多粘菌素来抑制BC因子的活性，由于多粘菌素纯度不高，混有内毒素，结果不理想。革兰阳性菌不影响检测，革兰阴性菌影响检测。
   
    真菌的细胞壁较为坚固，我们对真菌标准品和临床标本处理时，采用超声的方法，以破坏真菌的结构。有学者从真菌中提取出葡聚糖［7］。
   
    G因子法已用于测定间质性浆细胞肺炎血中的葡聚糖［8］，它可检测小鼠念珠菌病［9］和检测临床病人深层真菌感染［10］。
   
    文献报道，1ng～1μg葡聚糖与G因子可产生凝集反应［11］，与我们的结果相似。　我们的实验显示产生反应的葡聚糖的浓度较高，为200ng～100μg，可能与鲎试剂的敏感性不同有关。真菌或含有真菌的标本以10倍稀释，至少有3～4个浓度凝集反应显著，而细菌在8个稀释度中都有反应，另外真菌和革兰阴性细菌的时间反应曲线和时间速率曲线不同，用此方法可检测标本的真菌感染。我们将进一步分离G和B、C因子，进行特异性反应，可排除细菌对真菌检测的影响。
 
    【参考文献】

    1  Thomas. Current perspectives on ophthalmic mycoses. Clin Microbiol Rev， 2003， 16：730-797.   

    2  王丽娅.我国真菌性角膜炎的研究现状.眼科，2005，14：143-144.   

    3  Salierno， Goldstein Driebe. Fungal ring infiltrates in disposable contact lens wearers. Clao J， 2001， 27：166-168.   

    4  Karp， Tuli， Yoo， et al. Infectious keratitis after LASIK. phthalmology， 2003， 110：503-510.   

    5  国家药典委员会.中华人民共和国药典，二部，附录XI　E，细菌内毒素检查法，2005版，附录87.   

    6  Tsuchiya， Oishi， Takaoka， et al. Discrimination between endotoxin and (1～3)-beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate. Chem Pharm Bull (Tokyo)， 1990，38：2523-2526.   

    7  Williams， McNamee， Jones， et al. A method for the solubilization of a (1～3)-beta-D-glucan isolated from Saccharomyces cerevisiae. Carbohydr Res， 1991，219：203-213.   

    8  Yasuoka， Tachikawa， Shimada， et al. (1～>3) beta-D-glucan as a quantitative serological marker for Pneumocystis carinii pneumonia. Clin Diagn Lab Immunol， 1996， 3：197-199.   

    9  Nichterlein， Buchheidt， Hein， et al. Comparison of glucan detection and galactomannan enzyme immunoassay in gastrointestinal and systemic murine candidiasis. Diagn Microbiol Infect Dis， 2003， 46：103-108.   

    10  Ostrosky-Zeichner， Alexander， Kett， et al. Multicenter clinical evaluation of the (1～>3) beta-D-glucan assay as an aid to diagnosis of fungal infections in humans. Clin Infect Dis， 2005， 41：654-659.   

    11  Tsuchiya， Takaoka， Tokioka， et al.Development of an endotoxin-specific Limulus amebocyte lysate test blocking beta-glucan-mediated pathway by carboxymethylated curdlan and its application.Nippon Saikingaku Zasshi， 1990， 45：903-911.

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