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1.2.3 病理标本制作
按预定时间分别于烧伤后12 h,1,3,7,14 d将大鼠猝死后,沿角膜缘剪下角膜置于中性福尔马林溶液中。24 h后常规脱水,石蜡包埋,切片。
1.2.3.1 光镜标本
切片苏木素伊红染色（HE染色）,在光镜下观察炎症浸润情况,200倍及400倍显微镜下摄影。
1.2.3.2 免疫组织化学检测
切片厚4 μm,常规免疫组织化学方法制作。一抗分别为CD44和HA；其中CD44以柠檬酸缓冲液高温高压修复抗原20 min；HA用胃蛋白酶消化,37 °C 30 min修复抗原。用购自博士得公司的标准阳性对照片作阳性对照；阴性对照组以0.001 mol/L的PBS缓冲液代替一抗作为空白对照。
1.3 统计学处理
镜下表达阳性的角膜上皮细胞（包括基底层柱状细胞、翼状细胞和表层鳞状细胞）、机械划伤组各时间段阳性细胞数以x±s表示,采用SPSS 11.5统计软件多因素方差分析。
2 结 果
2.1 角膜碱烧伤后的临床表现
角膜碱烧伤后大鼠结膜高度混合充血,角膜水肿,烧伤区出现灰白色不透明浸润病灶,荧光素染色阳性,3 d后角膜浸润加重,烧伤区组织坏死,上皮脱落。10～14 d上皮开始修复, 角膜浸润减轻,烧伤区残留角膜斑翳和角膜白斑。
2.2 角膜碱烧伤后的组织学变化
切片HE染色,光镜下观察。碱烧伤后12～24 h可见烧伤区及附近炎症浸润,3 d后浸润加重,并向深处扩展,同时可见成纤维细胞。角膜上皮缺失,基底膜破坏,基质层纤维排列紊乱。7 d时细胞浸润仍然严重,2周后浸润减少,角膜上皮增生、移行、重新覆盖病灶处,成纤维细胞增多,基质修复。
2.3 角膜碱烧伤后CD44及HA的变化
正常时,CD44仅在基底层柱状上皮细胞细胞质、胞间和角膜基质中微量表达,烧伤后12 h即可见基质层和角膜上皮基底层表达增多,同时角膜鳞状细胞、翼状细胞出现CD44。表达于3～10 d达到高峰,广泛分布于角膜基质层、基底层柱状上皮细胞细胞质及胞间、鳞状和翼状上皮细胞（图1）。14 d后角膜上皮修复,在基底膜柱状细胞、基质中表达减少,在鳞状细胞、翼状细胞中表达消失（图2）。HA的表达同CD44。镜下表达阳性的角膜上皮细胞（包括基底层柱状细胞、翼状细胞和表层鳞状细胞）、机械划伤组各时间段阳性细胞数比较见表1。表1 200倍显微镜下CD44表达阳性的角膜上皮细胞（略）
3 讨 论
3.1 角膜碱烧伤的病理过程
角膜上皮形态上可分为表层的鳞状细胞,中层的翼状细胞和基底层的柱状细胞。柱状细胞为单层细胞,是角膜上皮中唯一具有分裂功能的细胞,在角膜创伤后上皮修复过程中起重要作用[2]。角膜损伤后上皮的迅速、有效重建是维持角膜透明、健康的必要条件,包括细胞再生、上皮移行、细胞分化,基底层的柱状细胞转变为表层的鳞状上皮细胞。角膜碱烧伤是细胞免疫和体液免疫共同作用的结果。T、B淋巴细胞、巨噬细胞活化,大量的多形核白细胞浸润[3],多形核白细胞发生“呼吸爆裂”,对角膜胶原组织进行溶解。大量实验和临床实践表明,角膜上皮的修复对于角膜碱烧伤的分级和预后有重要作用,上皮再生化至烧伤创面完全修复和炎症基本消退的时期是决定角膜碱烧伤预后的重要时期[4],采取有效方法促使角膜“重新上皮化”是促使角膜碱烧伤恢复的重要方面。
3.2 CD44及HA在角膜碱烧伤中的作用
CD44具有多种功能及结构形态,与其配体HA在胚胎发育、形态发生、伤口愈合及炎症反应中起重要作用[5]。FX等已证实,CD44及HA可介导细胞细胞、细胞细胞外基质之间的黏附[6]。本实验中,正常角膜中CD44表达极为微量,烧伤后表达增多,同时于修复、再生、移行的上皮细胞中出现。伴随修复的进行,CD44表达于3～10 d达到高峰,角膜上皮修复后CD44表达减少,在鳞状细胞、翼状细胞中表达消失,故可认为在角膜碱烧伤的复杂过程中,CD44及HA相结合,通过跨膜信号传递,使淋巴细胞和多形核白细胞活化,促进其移行、黏附和吞噬等生理功能的发挥。在上皮修复过程中,促进上皮细胞增生、分化、移行,介导细胞细胞间和细胞基底间黏附,并对上皮愈合提供力量,对创伤后的“重新上皮”化起到了促进作用。
【参考文献】
[1] Pfister R R. Chemical injuries of the eye [J]. Ophthalmology, 1983,90(10):12461253.
[2] 李凤鸣. 眼科全书[M]. 北京：人民卫生出版社,1997：1328.
[3] 张 栎,邱良秀,沈远平. 兔角膜碱烧伤的病理和纤维连接蛋白变化. 眼科新进展[J], 2000,20（2）：108109.
[4] Daly M, Tuft S J, Munro P M, et al. Acute corneal calcification following chemical injury[J]. Cornea, 2005,24(6):761765.
[5] Leonardi A. Invivo diagnostic measurements of ocular inflammation[J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol,2005,5(5):464472.
[6] Yu F X, Guo J, Zhang Q. Expression and distribution of adhesion molecule CD44 in healing corneal epithelia[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998,39(5):710717. 上一页 [1] [2] |
