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2 结 果
2.1 RCECs的体外培养情况
相差倒置显微镜下可见原代培养72h后，细胞自组织块边缘迁出，形态为多角形、鹅卵石样(图1A)，略有折光性，胞质色淡，可见胞质内少量细小颗粒，胞核圆形、透亮，核内可见1-2个圆形核仁。7 d后组织块周围形成单层片状细胞，细胞呈多角形、圆形或鹅卵石状，距离组织块较近的细胞形态接近生理状态的RCECs，但距离组织块较远的细胞可见伪足，胞体较大，呈星状或梭形。细胞生长至10 d左右，细胞接近融合期(图1B)，此时进行传代培养。传代后24h细胞贴壁，呈多角形、类圆形或梭形(图1C)；48 h细胞伸出胞突；5 d形成多角形外观，细胞开始汇合，逐渐接近正常RCECs形态，细胞呈单层生长，胞质丰富，核仁明显，细胞连接开始形成；10 d左右达最佳生长状态，形成良好的单层RCECs(图1D)。
2.2 NSE染色
胞质内可见粗大棕色颗粒，细胞核不着色，呈NSE阳性表达，显示本实验培养的细胞为神经嵴来源的RCECS(图2)。
2.3 MTT比色法测定结果
MTT比色法测定不同浓度ConA条件化培养基对RCECs生长的影响，结果提示各组间A值均有显著性差异(P<0.001)。两两比较，除10%与15%两组间无显著性差异外(P>0.05)，其余实验组间均有显著性差异(P<0.001)。15%与20%组细胞A值最高(表1)。表1 MTT比色法测定不同浓度ConA条件化培养基对RCECs生长的影响（略）
3 讨 论
3.1 RCECs的体外培养
本实验成功采用揭取角膜后弹力层及内皮细胞层联合组织块法进行RCECs的体外原代培养。观察到原代RCECs形态接近正常CECs，呈多角形、卵石样外观，随细胞增殖与细胞间汇合，逐渐形成单层排列，细胞形态接近活体RCECs。随细胞生长周期延长，胞质内逐渐出现空泡、颗粒，提示细胞老化。本实验中使用ConA条件化培养基，原代细胞出现老化状态较晚，一般发生在10-12 d以后。选择传代时机在生长第10天左右，此时细胞汇合率达80%以上，形成形态规则的单层细胞，细胞活性好，传代后易于贴壁、增殖。
传代RCECs的中央区细胞形态较周边区规则，细胞折光性好，周边细胞胞体较大，呈伸展后的类圆形或不规则形，与活体RCECs损伤后其周边代偿伸展移行的细胞形态相似。传代细胞在7-10 d时即形成单层细胞，此时细胞活性最佳，可进行细胞移植或其他实验操作。此后细胞逐渐出现接触抑制，生长停滞，胞浆内出现空泡及颗粒，细胞折光性下降，细胞老化。传代细胞密度不宜过低，应以8×104-1×105/mL为宜，密度过低可使细胞间相互作用减弱，细胞增殖能力下降。
本实验中使用ConA条件化培养基后，细胞老化时间推迟，推测ConA条件上清可使细胞保持相对幼稚化，但其具体机制有待进一步观察研究。
3.2 NSE免疫组织化学染色
NSE是一种存在于神经元及神经内分泌细胞中高特异性的蛋白质［2］。作为糖酵解酶之一的烯醇化酶普遍存在于生物体内糖酵解过程中，其同工酶有α、β、γ三种亚基。免疫组织化学研究发现，含有γ亚基的两种同工酶(αγ、γγ)高度特异性地定位于神经元和神经内分泌细胞，故又称为神经元特异性烯醇化酶。
NSE在人正常组织中分布较为广泛，脑组织中含量最高，其次是外周神经及神经内分泌细胞，在一些非神经组织中(如血液、脊髓液)中亦有存在。NSE曾被用于眼科肿瘤的诊断［3］。以往报道中曾证实神经嵴来源的小梁细胞NSE阳性表达，研究者现已将其作为小梁细胞的特异性检测指标之一［4］。Bhnke等［5］在长期培养CECs时发现，在分化较好的细胞中NSE表达呈强阳性，在未分化及变性的细胞中为弱阳性表达，而在角膜基质细胞、上皮细胞中均呈阴性，证实了CECs的神经嵴来源。近期在RCECs细胞系的建立过程中，也有学者将NSE作为细胞系建立成功与否的标准之一［6］。本实验中体外培养的原代RCECs呈多角形或卵石样，传代后其形态发生变异，仅依据形态特征无法进行准确鉴定，但NSE的阳性表达，可证实细胞的神经嵴来源，确定细胞为RCECs。
3.3 不同浓度ConA条件化培养基对RCECs生长的影响
Con A是一种植物凝集素，属于T细胞非特异性丝裂原，能选择性地与α-D-甘露糖残基结合，常被作为生化工具。研究发现，Con A可与细胞表面受体(如糖蛋白或细胞膜的糖脂)结合，从而活化细胞，诱导IL-2的生成和T淋巴细胞的增殖反应。其酪蛋白酶解产物等物质可激活细胞内的酪氨酸激酶，通过G蛋白的介导，活化第二信使，进而活化一系列信号转导系统，最终传递到细胞核内，启动DNA的复制，促进细胞增殖。ConA诱导小鼠或大鼠脾脏淋巴细胞上清(ConA条件上清)中含有多种细胞因子，如IL-1、IL-2、IL-6、bFGF等，也可能包含有多种免疫源性神经肽类激素及其他物质，可活化体内的神经内分泌免疫调节系统，体外实验可不同程度地直接刺激下丘脑、垂体和肾上腺组织分泌CRH、ACTH、CORT等神经肽类激素和皮质酮［7］。
有学者报道人的CECs存在ConA受体，可能与水代谢及衰老有关［8］。将CECs的培养上清直接转移到由ConA刺激的淋巴细胞增殖系统中，观察CECs释放的某些因子的抑制效应时发现，CECs对ConA刺激的淋巴细胞增殖系统具有非MHC限制性抑制效应，可能由于CECs通过细胞交互作用和(或)释放某些抑制性因子对淋巴细胞的活化和增殖发挥潜在的抑制作用。由此推断CECs可能是构成眼前房免疫赦免的因素之一［9］。
本实验首次使用ConA活化脾细胞培养上清液制成ConA条件化培养基，进行RCECs培养。ConA活化脾细胞后所分泌的多种生长因子具有显著的促细胞增殖作用。在脾细胞与ConA共同孵育24-48 h，其培养上清液中细胞因子含量达最高水平。本实验取此期的上清液配制ConA条件化培养基，结果显示ConA条件化培养基可促进RCECs的体外生长，缩短细胞培养周期，并保持细胞活性。其机制可能与ConA的有丝分裂效应有关。因此可将ConA活化脾细胞的条件上清液作为RCECs培养的辅佐剂。
【参考文献】
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