作者：张林，郝兆芹 作者单位：(西安交通大学医学院第一附属医院眼科，陕西西安 710061)
【摘要】 目的 观察非病毒载体阳离子聚合物(SofastTM)介导的编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的pEGFPN1和pIREEGFP两种质粒对体外培养的兔角膜内皮细胞(RCEC)的转染效率和转染前后细胞Na+K+ATPase活性变化，探索最优的体外RCEC非病毒载体基因转移条件。方法 消化法原代培养RCEC，SofastTM与pEGFPN1和pIREEGFP两种质粒按不同比例混合，介导此两种质粒转染RCEC，分别比较各质粒不同时间的转染效率，并检测转染与未转染细胞Na+K+ATPase的活性以确定基因转移对RCEC活性的影响。结果 SofastTM与质粒(pEGFPN1和pIREEGFP)按不同比例转染RCEC后，24-48h均有EGFP的表达。SofastTM∶pEGFPN1=3.2∶1组在转染后 48h时转染效率最高(P<0.05)，为3.6%。SofastTM∶pIREEGFP=3.2∶1组在转染后 24h时转染效率最高(P<0.05)，为3.5%。转染与未转染组细胞数和细胞Na+K+ATPase活性均无明显差异。结论 SofastTM可有效介导以pEGFPN1和pIREEGFP为载体的外源基因向体外培养的RCEC转移，且基因转移后RCEC活性不受影响。
【关键词】 角膜内皮细胞；阳离子聚合物；基因转移；Na+K+ATPase
Transferring gene to rabbit corneal endothelial cells in vitro by cationic polymer
Zhang Lin, Hao Zhaoqin
(Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To observe the transfection efficiency of transferring plasmids pEGFPN1 and pIREEGFP encoding enhanced green fluorescent protein (EGFP) to rabbit corneal endothelial cells (RCECs) by cationic polymer and the change of cell activity by detecting the activity of Na+K+ATPase. Methods RCEC was cultured by digestion and identification by neurone specific enolase(NSE) stain. Sofast TM mediated plasmid pEGFPN1 and pIREEGFP to transfect RCECs and we compared the transfection efficiency at different time and in different groups by calculating the number of fluorescent cells. We observed the activity change of transfection and nontransfection RCEC by detecting the activity of Na+K+ATPase. Results After pEGFPN1 and pIREEGFP transfected RCEC with Sofast TM by different ratio, RCEC expressed EGFP in 24-48h. After transfection 48h the group of SofastTM∶pEGFPN1=3.2∶1 had the max transfection efficiency 3.6% and the max transfection efficiency of group SofastTM∶pIREEGFP =3.2∶1 was 3.5%, at 24h after transfection. There were no obvious differences between the transfection and nontransfection groups of cell number and activity of Na+K+ATPase. Conclusion Sofast TM can mediate exogenous gene trasfering to RCEC effectively. pEGFPN1 and pIREEGFP are the suitable nonvirus vectors for gene transferring to RCECs.
KEY WORDS: corneal endothelial cells; cationic polymer; gene transfer; Na+K+ATPase
角膜内皮层是位于角膜内面的细胞单层，是角膜基质与房水的分界，其屏障及泵功能对于保持角膜的透明性、基质的脱水状态及角膜正常厚度起着关键作用。人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cell, HCEC)增殖能力有限，如何有效提高HCEC的增殖是进行HCEC移植和构建组织工程化角膜[12]的关键。基因转移技术可将外源基因转入正常细胞，通过外源基因的表达来改变细胞的一些生理特性，进而达到促细胞增殖、诊断和治疗疾病的目的，正逐步应用于实验研究和临床。本实验通过SofastTM介导编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的pEGFPN1和pIREEGFP两种质粒转染兔角膜内皮细胞(rabbit corneal endothelial cell, RCEC)，观察外源基因在RCEC的表达，检测转染组与未转染组RCEC Na+K+ATPase活性的变化，探讨最优的体外RCEC 非病毒基因转移条件，为进一步将有促HCEC增殖和治疗功能的外源基因导入HCEC奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物 成年健康新西兰白兔40只(西安交通大学医学院实验动物中心提供),体重1.5-2.0kg，均无眼疾，雌雄兼备。
1.2 主要试剂及仪器 质粒pEGFPN1和pIREEGFP为天津医科大学李曦铭博士惠赠。质粒提取试剂盒购自北京天为时代科技有限公司。SofastTM 转染试剂购自厦门太阳马公司。RPMI 1640购自GIBCO。胎牛血清购自杭州四季青公司。考马斯蓝蛋白测定试剂盒、超微量ATP酶测试盒由南京建成生物工程研究所提供。CO2培养箱、倒置显微镜、手握式细胞匀浆器、722分光光度计均由西安交通大学医学院遗传与分子生物学实验室提供。倒置荧光显微镜(OLYMPUS)由西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科提供。
1.3 RCEC体外培养 将兔经耳缘静脉空气栓塞处死后立即取出眼球，无菌条件下剪除眼球周围组织，庆大霉素生理盐水(400u/mL)冲洗，然后浸泡于庆大霉素生理盐水中4℃保存。30min后转入无菌间，在超净工作台内的解剖显微镜下，于角膜缘内1mm处360°环形剪取角膜片，内皮面向上至培养皿中，沿角膜片边缘揭取后弹力层，内皮面向上置于预置PBS的另一培养皿中，经PBS漂洗后移入消化液(2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA 1∶1混合)中，37℃孵育20-25min，倒置显微镜下观察内皮细胞松散，间隙变宽，部分脱落时，加入含FBS的培养基终止消化，吹打使细胞脱落，将后弹力层剪碎后继续吹打，倒置显微镜下观察细胞已吹开，后弹力层已无细胞黏附时收集细胞悬液离心，1500转离心15min，PBS 重悬后再离心，血细胞计数板计数细胞，以1×105个cell/mL接种24孔板。
1.4 RCEC的鉴定 原代接种细胞达到80%融合时，用胰酶消化后做细胞爬片，免疫组化SABC法进行NSE染色，DAB显色，镜检观察。
1.5 转染及外源基因的表达 原代接种细胞贴壁后48h进行转染。SofastTM/DNA按重量比1.6∶1、2.4∶1、3.2∶1、4∶1分别稀释混合后加入各孔，每种比率5个复孔。实验组分两大组：一组为质粒pEGFPN1组 (按比例由小到大分为5组)；另一组为质粒pIREEGFP组(分5组)。不进行转染的5孔为对照组。转染后24、48h时，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。每孔随机选取5个视野，分别计数光镜和倒置荧光显微镜下的细胞个数，然后取平均值。
1.6 Na+K+ATPase活力的测定 将实验组中EGFP表达率最高的组与对照组细胞分别消化、离心，弃上清，留下层细胞，用4℃生理盐水制备成105 cells /mm3匀浆，用匀浆器在冰上进行破碎，制备细胞悬液备用。使用考马斯亮蓝试剂盒测定细胞悬液中蛋白含量。按照超微量ATP酶测试盒说明书进行ATP酶检测。按以下公式计算:蛋白含量(g/L)=(测定管吸光度/标准管吸光度)×标准管质量浓度(g/L)。Na+K+ATPase活力(u/mg prot)=[(测定管A值-对照管A值)]÷(标准管A值-空白管A值)×标准管浓度(0.1μmol/mL)×6÷匀浆蛋白含量(mg prot/mL)。
1.7 统计学处理 实验数据采用SPSS 13.0软件处理，统计数据用±s表示，采用重复测量(Repeated measures)中最小显著法(LSD)进行统计学分析。
2 结果
2.1 倒置显微镜下观察原代RCEC的生长状况 原代接种后4-6h细胞贴壁，呈圆形，胞浆透亮，核居中(图1)；24-48h细胞由圆形逐渐伸展变成不规则形；48h后细胞逐渐变成规则的多边性，核圆、居中，呈集落状生长(图2)；至6-7d时各集落融合成细胞单层，细胞排列紧密，呈典型的铺路石样(图3)。
2.2 NSE染色 RCEC经NSE染色，苏木素复染，DAB显色后，可见胞浆内粗大的棕色颗粒，胞核蓝色，呈NSE阳性表达(图4)。证实本实验所培养的细胞为神经脊来源的RCEC。
2.3 外源基因的表达分析 因各孔接种细胞数相等，所以可用荧光细胞个数代表转染效率进行检验，以下结果均以荧光细胞个数为基础。SofastTM与质粒(pEGFPN1和pIREEGFP)按不同比例转染RCEC后，24-48h均有EGFP的表达，对照组未见表达EGFP的细胞。不同比例的SofastTM∶pEGFPN1各组间转染效率存在差别(P<0.001)，各组间多重测量表明4.0∶1组与其他三组转染率均有明显差异(P<0.001)，其他三组间的转染率无明显差异(P≥1.07)；不同时间，转染效率不同(P<0.001)；分组与转染时间间有交互作用(P<0.05)；SofastTM：pEGFPN1=3.2∶1组在转染后48h时转染效率最高，为3.6%(光镜下每视野细胞计数平均为200个)，其95%可信区间为(6.859，9.541)(图5，表1)。不同比例的SofastTM∶pIREEGFP 各组间转染效率存在显著差异(P<0.001)，各组间多重测量表明3.2∶1组的转染率与其他三组有显著差异(P<0.05)，其他三组间的转染率无明显差异(P≥0.181)；不同时间，转染效率无显著差异(P=0.192)；分组与转染时间间有交互作用(P<0.05)；SofastTM∶pIREEGFP=3.2∶1组转染后24h时转染效率最高，为3.6%(光镜下每视野细胞计数平均为200个)，其95%可信区间为(7.001，9.399) (图6，表2)。
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