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图1 原代培养的兔角膜内皮细胞4-6h（略）
Fig.1 Morphous of primary cultured RCECs, 4-6h ×100
图2 原代培养的兔角膜内皮细胞(48h后)（略）
Fig.2 Morphous of primary cultured RCECs after 48h ×200
图3 原代培养的兔角膜内皮细胞(6-7d)（略）
Fig.3 Morphous of primary cultured RCECs after 6-7d ×200
图4 RCEC NSE 染色鉴定（略）
Fig.4 Identification of RCEC with NSE staining SABC ×400
图5 pEGFPN1转染RCEC 48h，EGFP表达（略）
Fig.5 Expression of EGFP after transfecton 48h by pEGFPN1 ×200
图6 pIREEGFP转染RCEC 24h，EGFP表达（略）
Fig.6 Expression of EGFP after transfecton 24h by pIREEGFP ×200
表1 pEGFPN1组24、48h时转染阳性RCEC数（略）
Table 1 The number of transfected RCECs after transfection 24h and 48h in pEGFPN1 group
Note: Letter a indicates the group(SofastTM∶pEGFPN1=4.0∶1) is different from the others
2.4 各组细胞数和细胞Na+K+ATPase活性差异分析 与对照组相比SofastTM 介导pEGFPN1和pIREEGFP转染RCECs后，细胞数量和Na+K+ATPase活性无显著性差异(P>0.05，表3)。
表2 pIREEGFP组24、48h时转染阳性RCEC数（略）
Table 2 The number of transfection RCEC, after transfection 24h and 48h in pIREEGFP group
Note: Letter b indicates the group (SofastTM∶pIREEGFP=3.2∶1) is different from the others
表3 对照组与实验组细胞数和细胞Na+K+ATPase活性（略）
Table 3 The number of RCECs and the activity of Na+K+ATPase of RCECs in different groups
*P>0.05 vs. control
3 讨论
角膜内皮细胞(corneal endothelial cell, CEC)的体外培养方法已基本建立，较常用的有组织贴片培养法、揭膜法和酶消化法。组织贴片培养法最简单但易引起上皮和基质细胞的混入，揭膜法获得细胞纯但易污染，消化法在角膜材料较多时可一次提供大量细胞，但易对细胞造成损伤。本实验对消化法进行了改良，采用单纯消化配合剪切的方法既易于细胞自后弹力层脱落保证足够的细胞量，又避免酶对细胞过度损伤。经改良消化法原代培养的RCEC 4-6h贴壁，24-48h时RCEC由圆形逐渐伸展为不规则的多边形，48h后变为规则的多边形，6-7d融合成细胞单层，呈典型的铺路石样，胞浆透亮，核居中。虽然细胞未形成典型的六边形形态，但研究[3]已证实RCEC的活性与功能并不影响。NSE是神经来源组织所表达的一种特异性酶[4]。大多学者认为，CEC来源于神经脊，故可将NSE作为一种鉴定CEC的标志酶。RCEC经NSE+苏木素复染后，可见胞浆内粗大的棕色颗粒，胞核呈蓝色，呈NSE阳性表达。证实本实验所培养的细胞为神经脊来源的CEC。HCEC培养是进行HCEC移植和构建组织工程化角膜的基础。因为HCEC体外增殖能力有限, 以往只是在培养基中添加促细胞增殖的生长因子，如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等，但其促增殖效果并不理想。近年来基因转移技术正作为一种全新的方法，逐步应用于试验研究及临床疾病的诊断和治疗。基因转移的载体有病毒与非病毒载体之分，病毒载体转染效率高，传统的基因转移多以病毒载体为主，如Aboalchamat[5]和Bwdnarz等[6]先后用病毒载体将SV40 T抗原转入HCEC获得了永生化的HCEC；随后Shin 等[7]又用HPV E6E7原癌基因建立RCEC细胞系，并检测到Na+/K+ ATP活性增高；Hsiao等[8]用重组表达SV40 T/t抗原的腺病毒载体转染HCEC，发现可提高创伤愈合力和增殖能力，转染细胞可保留形态学特征；Liu [9]等用重组腺病毒介导酸性成纤维生长因子对HCEC进行转染，发现可显著促进CEC的增殖能力；Tsai等[10]发现诱导型携带转基因的腺相关病毒(rAAV)载体可稳定携带转基因，并对RCEC功能无损伤。肿瘤病毒或致瘤病毒载体虽然转染效率高，但可使转染细胞丢失一些生物学特性，并面临致瘤的危险，而非病毒载体虽然转染效率低，但可保持细胞的正常生理功能。越来越多的学者将目光移到非病毒载体上。目前非病毒载体介导的对正常细胞进行的基因转移的有关报道大多用的是脂质体，其原理是脂质体与DNA质粒利用它们之间的静电作用形成复合体，此复合体再与细胞表面形成静电作用，进入细胞内。Hart等[11]证明了脂质体载体可以转染兔角膜内皮和上皮细胞，但是其转染效率较病毒载体低[12]。阳离子聚合物工作原理类似于脂质体,主要是在带有阳离子的聚合物和充有阴离子的DNA之间形成复合物，然后吸附到细胞表面进入细胞内，其转染效率也相对较低。但是阳离子聚合物有利于保护DNA免受内核体的破坏[13]，且价格较低。因此本试验选用阳离子聚合物SofastTM。pEGFPN1和pIRESEGFP均为较常用的携带外源基因的质粒。pEGFPN1适于携带较短基因片段而pIRES2EGFP适于携带较大片断，且二者都有报告基因EGFP，可直接在荧光显微镜下观察报告基因表达情况。本试验选用阳离子聚合物SofastTM介导pEGFPN1和pIRESEGFP转染RCEC，结果表明其可有效介导外源基因转染RCEC，转染细胞与未转染细胞的数量及Na+K+ATPase活性基本一致，证明阳离子聚合物介导的基因转移并不影响RCEC的生物学活性，无毒副作用，可用于CEC的基因转移和治疗。角膜内皮基因转移是角膜内皮基因治疗的基础，通过基因转移对角膜移植前供体进行基因修饰可提高CEC功能，降低术后排斥反应的发生；通过基因转移促进CEC增殖可直接体内治疗因角膜内皮损伤所致的角膜病变，从而代替穿透性角膜移植术，降低排斥反应，克服术后散光、新生血管以及供体不足等缺点。该实验方法的建立，为进一步寻找最佳基因转入载体，开展CEC的基因转移和治疗打下良好基础，对CEC移殖的临床应用和角膜病的基因治疗有很好的应用前景。
【参考文献】
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[11]Hart SL, ArancibiaCarcamo CV, Wolfert MA, et al. Lipidmediated enhancement of transfection by a nonviral integrintargeting vector [J]. Hum Gene Ther, 1998, 9(4):575585.
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