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兔晶状体上皮细胞和人成纤维细胞在雷帕霉素涂层人工晶状体表面的生长

http://www.cnophol.com 2009-12-29 10:56:04 中华眼科在线

  2.3.2人胚肺成纤维细胞在人工晶状体表面的生长  人胚肺成纤维细胞在三组人工晶状体的表面分布明显不同,差异有统计学意义(KruskalWallis Test χ2=95.041,P=0.000)。在雷帕霉素涂层处理组(a组)细胞生长稀疏,便于进行计数(图4A),在高分子PLGA组(b组)和普通空白人工晶状体组(c组)表面细胞生长密集,细胞数量无法进行计数(图4B,表2)。a组与b组或c组相比差异有统计学意义(χ2=65.235,P=0.000;χ2=67.326,P=0.000)。b组和c组细胞分布差别无统计学意义(χ2=0.775,P=0.856)。同一晶状体的1~4区域与5~8区域即人工晶状体的外围与中央细胞分布无统计学差别(mannwhitney U test P=0.799,P=0.799,P=0.799)。

  表1晶状体上皮细胞在IOLs表面生长分布疏密分级情况(略)

  表2人胚肺成纤维细胞在IOLs表面生长分布疏密分级情况(略)

  2.4 MTT法检测人工晶状体表面细胞增殖情况  兔晶状体上皮细胞与人工晶状体共同培养的MTT法检测中,吸光值在三组之间各不同,A组吸光值为0.2079±0.0215,B组、C组吸光值分别为0.5161±0.0526,0.5227±0.0671。经oneway ANOVA检验A组与B、C组间比较差异有统计学意义(F=123.352,P=0.000)。Post Hoc Tests, LSD检验A和B,A和C相比差异有统计学意义(P=0.000),B和C组相比差异无有统计学意义(P=0.786)。在人胚肺成纤维细胞与人工晶状体共同培养的MTT法检测中,吸光值在三组之间也有差别。a组吸光值为0.2745±0.0437,b组、c组吸光值分别为0.7776±0.0786,0.7508±0.0673。经oneway ANOVA检验a组与b、c组间比较差异有统计学意义(F=167.803,P=0.000)。Post Hoc Tests, LSD检验a和b,a和c相比差异有统计学意义(P=0.000),b和c相比差异无统计学意义(P=0.389)。

  图4  光镜下观察人胚肺成纤维细胞在人工晶状体表面的分布生长(略)  

  A:为雷帕霉素涂层人工晶状体表面细胞的生长状况,细胞稀疏,可以进行计数;B:为高分子涂层材料PLGA涂层人工晶状体表面细胞的生长状况,细胞密集,无法进行计数

  3讨论
   
  后发性白内障的发生主要与残留于晶状体赤道部的晶状体上皮细胞的增殖、移行、纤维化生有关。已有大量的研究通过不同作用机制的药物来抑制晶状体上皮细胞增生速度。应用药物的途径常见的有以下几种:药物直接注射到前房、灌注液中加入药物,调整人工晶状体成分。通过人工晶状体本身释放药物系统具有一定优势,便于控制药物浓度,局部可以达到较高药物浓度,利于原位抑制具有潜在增殖能力的细胞[7]。本研究应用专利技术将高分子缓释材料PLGA联合雷帕霉素通过静电喷涂沉积设备喷涂层至人工晶状体的光学区的外围,通过药物的缓慢释放,持续、直接地作用于晶状体上皮细胞,避免了一次给药造成的毒性作用。
   
  相差显微镜下直接观察细胞在人工晶状体表面的分布情况表明,雷帕霉素涂层人工晶状体的表面的细胞分布情况为0~2级,而空白对照组则为1~3级之间,各组细胞疏密程度具有明显的差异。MTT 法是目前检测细胞增殖与活性的常用方法, MTT (四甲偶氮唑盐),其四氮唑环可在活细胞线粒体脱氢酶作用下断裂生成紫蓝色formazan,并沉积在细胞中,formazan 的数量与活细胞数成正比。本次实验检测空白对照组吸光值为雷帕霉素组的2~3倍之间,无论是直接计数法还是通过MTT法都证实雷帕霉素涂层的人工晶状体具有抑制细胞增殖的作用。这就为下一步将雷帕霉素涂层处理的人工晶状体植入体内抑制后发性白内障提供了可能。
   
  喷涂高分子PLGA材料组的涂层区域(5~8区域)与非涂层区域(1~4区域)细胞的分布无差别,细胞生长密集,说明涂层工艺是合格的,涂层人工晶状体表面仍然是光滑平整,不影响细胞的生长分布,既具有良好的生物相容性。可降解的高分子PLGA是脂肪族聚酯族的一种,由聚丙交酯(聚乳酸,PLA)及聚乙交酯(PGA)依据不同比例聚合而成,具有较好生物相容性,在美国已获 FDA批准并应用于临床[8]。具有易于合成、质量稳定、生物惰性、生物可降解性、降解速度可调节性和良好的可塑性的特点[9]。丙交酯(LA)与乙交酯(GA)降解速度不同,PGA降解较快,一般为 4wk左右,而PLLA降解较慢,至少3mo以上,PLGA可以通过控制LA与 GA比例来调节体内降解速率。PLGA在体内逐渐降解成羟基乙酸和α羟基丙酸,并参加三羧酸循环,生成二氧化碳和水,被机体吸收。
   
  雷帕霉素是从放线菌目潜水镜样链霉菌中分离获得的一种亲脂性大环内酯类抗生素,易通过细胞膜,一种新型免疫抑制剂,1989 年被批准用于治疗器官移植后的免疫排斥反应。雷帕霉素由于其有极好的抑制新生内膜过度增殖的效应,近年来受到心脏病学界的极大关注。将RAPA涂层在冠状动脉支架的表面,在置入支架的同时进行局部药物释放来预防支架内再狭窄,继动物模型上的研究取得了令人鼓舞的结果后,其有效性及安全性在大量的临床试验中也得到证实[10 ]。雷帕霉素具有以下生物学作用:(1)抗增生作用:通过与雷帕霉素耙蛋白(mTOR)结合抑制多种刺激因子的细胞增殖,使细胞停留在细胞周期G1 期的晚期,阻止细胞进入S期。(2)抑制免疫反应、抗炎症作用:通过与IL2结合抑制T细胞的功能来发挥抑制免疫反应的功能;雷帕霉素也通过抑制环氧合酶途径,参与发生炎症反应的花生四烯酸代谢[11]。(3)雷帕霉素涂层支架的特殊优势:RAPA作为涂层支架的理想药物除了因为其特殊的药理作用外,还与它本身的物理特性有关,RAPA具有很高的亲脂特性,很容易通过细胞膜进入细胞内,使血管壁局部组织保持较高药物浓度。雷帕霉素局部应用未见有任何毒副作用的报道,人体冠状动脉血管内植入雷帕霉素涂层支架的雷帕霉素含量为140μg/cm2无任何的毒副作用[12],本实验所用雷帕霉素的剂量远小于血管支架涂层用量。全身应用发现的副作用(有增加感染性肺炎发生几率的报道[13])有剂量依赖性,并且为可逆性,治疗剂量的RAPA尚未发现有明显的肾毒性,无齿龈增生[14]。
   
  总之,将高分子缓释材料PLGA联合抗增殖药物雷帕霉素涂层至人工晶状体的外周,可以制备出生物相容性好、不影响透光性的表面处理人工晶状体,同时可以起到直接抑制晶状体上皮细胞的作用。雷帕霉素对晶状体上皮细胞的其他生物学行为的影响、有无毒副作用、药物释放浓度变化情况等尚需进一步观察,为雷帕霉素涂层人工晶状体早日植入体内提供依据。

  【参考文献】

  1刘红玲,张晓梅,关风.晶状体后囊膜混浊的研究方法及细胞生物学研究进展.国际眼科杂志2007;7(2):457459

  2 Ranta P, Tommila P, Immonen I, et al. Retinal breaks before and after neodymium: YAG posterior capsulotomy. J Cataract Refract Surg 2000;26:11901197

  3 Akerele T, Minasian M, Little B, et al. Posterior dislocation of Staar plate haptic silicone lenses following Nd: YAG capsulotomy. Eye 1999;13:700702

  4 Cxinal A.Intraocular lens position after capsulotomy. J Cataract Refract Surg 2000;26:56

  5 Ge J, Wand M, Chiang R, et al. Longterm effect of Nd: YAG laser posterior capsulotomy on intraocular pressure. Arch Ophthalmol 2000;118:13341337

  6王桂琴,孙惠敏,袁佳琴,等.表面修饰人工晶状体生物相容性的研究.透析与人工器官1998;9(1):3034

  7 Wormstone IM. Posterior capsule opacification: A cell biological perspective. Exp Eye Res 2002;74: 337347

  8 Gilding DK. Biodegradable polymers. In: Biocompatibility of Clinical Implant Materials,edited by Williams DF,Boca Raton, FL,CRC Press 1981:209232

  9 Pan CJ, Tang JJ, Weng YJ, et al. Preparation and characterization of rapamycinloaded PLGA coating stent. J Mater Sci: Mater Med 2007;18:21932198

  10 Marx SO, Marks AR. The development of rapamycin and its application to stent restenosis. Circulation 2001;104(8):852855

  11 Ohia EO, Mancino M, Kulkarni PS. Effects of steroids and immunosuppressive drugs on endotoxinuveitis in rabbits. J Ocul Pharmacol 1992;8:295307

  12 Sousa JE, Costa MA, Abizaid A, et al. Lack of neointimal proliferation after implantation of sirolimuscoated stents in human coronary arteries: a quantitative coronary angiography and threedimensional intravascular ultrasound study. Circulation 2001;103(2):192195

  13 Kahan BD, Julian BA, Pescovitz MD, et al. Sirolimus reduces the incidence of acute rejection episodes despite lower cyclosporine doses in caucasian recipients of mismatched primary renal allografts: a phase II trial. Rapamune Study Group. Transplantation 1999;68(10):15261532

  14 Groth CG, Bckman L, Morales JM, et al. Sirolimus (rapamycin)based therapy in human renal transplantation: similar efficacy and different toxicity compared with cyclosporine. Sirolimus European Renal Transplant Study Group. Transplantation 1999;67(7):10361042

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(来源:互联网)(责编:xhhdm)

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