【摘要】 目的：研究改良甘油长期冷冻保存角膜的超微结构及板层角膜移植。方法：将涂有透明质酸钠(sodium hyaluronate，SH)的角膜片在45℃以下长期甘油低温冷冻保存，保存12mo之后，用于15例板层角膜移植并进行透射电镜检查。结果：15例手术均顺利，术后随访6～24mo，13例植片透明，1例植片呈半透明状，1例植片部分新生血管化。透射电镜检查显示角膜超微结构保存良好。结论：甘油长期冷冻保存角膜有一定活性，适合应用板层角膜移植。
【关键词】 板层角膜移植;超微结构;低温冷冻;角膜保存;甘油;透明质酸钠
The ultrastructure of corneas preserved by longterm cryopreservation with improved glycerol and lamellar keratoplastyJunHua Fan, XueXi Li, DongPing PanFoundation item: Key Project of the Fund for Medical and Health in “11st FiveYear Plan” of Nanjing Military District, China(No.06MA105)e Center, the 180th Hospital of PLA, Quanzhou 362000, Fujian Province, China AbstractAIM: To study the ultrastructure of comeas preserved by longterm cryopreservation with improved glycerol and to study the lamellar keratoplasty.METHODS: The corneas coated with sodium hyaluronate were longterm preserved in 45 ℃ glycerol. After 1 year, 15 cases accepted lamellar keratoplasty with the longterm preserved cornea, and the cornea taken transmission electron microscopy(TEM) examination.RESULTS: All surgeries were successful, and patients were followed up for 6 to 24 months. 13 grafts were transparent, 1 graft was translucent, and 1 graft was neovascularization. TEM examination showed that the ultrastructure of cornea was wellpreserved.
CONCLUSION: The improved longterm cryopreservation with glycerol could preserve some viability of cornea. It is a proper way of preservation that could be used for lamellar keratoplasty in clinic when there is no fresh corneas.
KEYWORDS: lamellar keratoplasty; ultrastructure; lowtemperature refrigeration; corneal preservation; glycerol; sodium hyaluronate
0引言
甘油用作角膜保存已有较长的历史，但传统甘油保存法保存的角膜一般时间不超过6mo，且活性差，用于板层角膜移植透明率不高[1，2]，临床应用明显受限。我们对传统的甘油保存法进行了改进，经电镜检查及临床应用，均取得了较好效果。
1对象和方法
1.1对象
将药用无水甘油装于125mL磨口广口瓶内，置于140℃电烤箱内消毒2h后置于4℃的冰箱备用。对符合眼库医学标准的15个供体新鲜眼球,按照眼库常规无菌处理后，于角膜缘处做穿刺口，排出房水，注入透明质酸钠(sodium hyaluronate，SH，山东正大福瑞达公司)，然后于角膜缘后2mm处完整剪下角膜，于角膜内皮面注满SH，上皮面也均匀涂上SH。将角膜内皮面向上小心置于准备好的甘油内，然后置于45℃冰箱内保存。保存时间1～3a。角膜皮样瘤患者7例，男5例，女2例，年龄10～18岁;边缘性角膜变性穿孔患者3例，男2例，女1例，年龄25～45岁;外伤性角膜深板层缺损5例，男4例，女1例，年龄20～42岁。
1.2方法
自45℃甘油中取出保存角膜片后,立即置于4℃ 100mL的平衡盐液中，每2min轻轻漂洗1次，使粘连的甘油洗去，5min后再转置于另一杯相同液体中，再复水5min。选择大小适当的环钻于植床上对角膜病损区进行钻切打印，尽量将病损区包括于钻切范围内，然后沿钻切出来的印迹剖切去除病损的板层角膜组织。采用这种方法可以制作出边缘光滑平整的不同形状的植床，包括类椭圆形、新月形等。将复温复水后的供体角膜置于切割枕上，根据植床大小选择等于或大于植床直径0.25mm的环钻进行钻切，再于显微镜下对钻切下来的角膜组织根据所需板层厚度进行剖切。将板层角膜植片移植于植床并以100线间断缝合。术后处理同常规板层角膜移植。将取材后剩下的角膜立即以30g/L戊二醛固定送透射电镜检查。
2结果
手术15例均顺利，无术中并发症。术后随访6～24mo，无植片溶解、脱落，13例植片透明，1例植片呈半透明状，1例位于角膜缘的植片部分新生血管化。上皮细胞形态自然，细胞连接紧密，细胞核染色质较均匀。胶原纤维大小均匀，排列整齐、紧密，连续性好，无崩解(图AC)。
3讨论
细胞在冷冻状态下，代谢几乎停止，生命以相对静止状态得到保存，但是，在缓慢降温或升温时，水分子会有序排列形成冰晶，而冰晶化是造成细胞不可逆性死亡的主要原因[3]。甘油属多羟基化合物，羟基与水形成氢键，因此甘油具有很强的亲水性，可以轻易渗透至细胞内，限制和干扰细胞内外水分子按晶格排列形成冰晶，从而减轻冷冻过程对细胞造成的损害;另外，甘油渗入细胞内部，置换出细胞内的游离水和一些盐类，减轻了电解液浓度增加带来的不良影响;甘油还可保护细胞内的一些重要酶类免受冻害而逸出，从而保证解冻后细胞的活性;此外，甘油是很好的溶剂，易清洗,并具有抑菌作用[3]。甘油用作冷冻保护剂已有100余年的历史，是最为常用的冷冻保护剂，被广泛应用于红细胞、精子、细菌、人体组织器官等的长期活性保存[46]。在眼科领域，既往多利用甘油的脱水性能在4℃下对眼球进行保存，而非利用其冷冻保护剂的作用[1,2,7]。4℃下细胞代谢并未完全停止，加上甘油脱水的损害作用，这种方法保存的角膜组织没有活性，电镜检查显示角膜胶原组织的连续性、均匀性及紧密性均较差，临床应用效果欠佳，只是起到了纤维支架的作用，移植后植片多混浊[1]。借鉴甘油作为冷冻保护剂在其它领域的成功应用，我们详细分析了甘油低温冷冻保存角膜各个环节，充分考虑了可能影响保存效果的因素，对原来的甘油保存角膜方法进行了改造，从而形成一种新型的甘油冷冻保存角膜的方法。
本方法与传统保存方法的不同之处在于：(1)45℃以下低温冷冻保存，使细胞内外液体达到玻璃化，彻底抑制细胞代谢;(2)采取保存角膜片的方式而非保存眼球的方式进行保存。角膜片相对眼球而言体积小，含水少，因此能极大缩短冷冻或复温的时间，能使细胞内外的液体迅速达到玻璃态，从而避免有损细胞结构的冰晶形成[8];(3)角膜内皮及上皮面涂抹SH后，减缓了脱水的速度，避免了因细胞脱水迅速而导致的细胞骨架坍塌、细胞连接破坏等机械性损害，也有利于甘油置换出胞质内的水分，从而防止因胞质浓缩导致的电解质浓度升高引起的化学淹滞性损害[3];(4)SH能保护细胞免受各种毒素及机械震动对细胞产生的损害作用[9，10]。电镜检查及临床应用结果表明，45℃以下长期甘油低温冷冻保存的角膜具有一定的活性，角膜结构保存完整，进行板层角膜移植有较高的透明率，基本符合临床板层角膜移植的要求。
【参考文献】
1蓝平，高明宏，阎玲，等.长期甘油保存角膜的光镜和电镜观察及临床应用.解放军医学杂志 2001;26(3)：206
2邓爱军,康凤英,祝寿荣,等.甘油干燥保存角膜内皮细胞活性的研究.山东医药 2000;40(14)：56
3中国农业大学.家畜繁殖学.第3版.北京：中国农业出版社 2000：160185
4 Hibino Y, Hata K, Horie K, et al. Structural changes and cell viability of cultured epithelium after freezing storage. J Craniomaxillofac Surg 1996;24(6):346351
5韩颖,刘安,靳鹏,等.冰冻干燥红细胞超微结构的分析.中国实验血液学杂志 2003;11(2)：191193
6郭淑清,田锋.菌种的甘油冷冻保存法.山西医科大学学报 2000;31(4):382
7张廷钺,马吉献,于纯智.干燥保存角膜穿透移植实验与排斥反应.眼科新进展 1995;15(1)：46
8范军华，蒋华.甘油冷冻长期保存兔角膜内皮细胞的活性.国际眼科杂志 2006;6(3)：573577
9凌沛学.透明质酸.北京:中国轻工业出版社 2000：5362
10 Belda JI, Artoa A, GarciaManzanares MD, et al. Hyaluronic acid combined with mannitol to improve protection against freeradical endothelial damage: experimental model. J Cataract Refract Surg 2005;31(6): 12131218 |
