【摘要】 目的：探讨血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)与羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)眶内植入物纤维血管化形成的相关性，以及地塞米松抑制羟基磷灰石植入物纤维血管化的机制。方法：家兔20只随机分为实验组与对照组,每组10只;各组均采用HA植入物植入兔眼眶。术后滴妥布霉素滴眼液4次/d，实验组术后48h起隔日球周注射地塞米松0.5mg和实验结束，并观察两组的结膜生长情况;实验组与对照组分别于术后 3，7，14，21，28d摘取2只HA植入物行免疫组织化学检测VEGF阳性表达情况。结果：羟基磷灰石植入物纤维血管化与VEGF的表达存在显著的相关性。术后 14d,实验组HA炎性细胞浸润明显减少,实验组VEGF表达明显低于对照组。结论：羟基磷灰石植入物纤维血管化与炎症反应密切相关,VEGF可能参与了纤维血管化形成过程 ,地塞米松可能通过抑制植入物的炎症反应及 VEGF的表达。
【关键词】 血管内皮细胞生长因子;羟基磷灰石;眼眶植入物;纤维血管化;炎症反应
Expression of vascular endothelial growth factor in hydroxyapatite orbital implants
Teng Fang, QiuMing Li, JianXiang Lu, HuaE Shu, Fang Liu
Department of Ophthalmology, the Second Peoples Hospital of Jiaozuo, Jiaozuo 454001, Henan Province,China; Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Abstract AIM: To investigate the relevance of formation of fibrovascularization between vascular endothelial growth factor (VEGF) and hydroxyapatite(HA) orbital implants; and the mechanism of dexamethasone suppression on fibrovascularization of HA implants. METHODS: Twenty rabbits were randomly divided into experimental group and control group with 10 in each; each group were used HA implants implanted in rabbit eyes and tobramycine eyedrop was used 4 times per day postoperatively. Peribulbar injection of dexamethasone 0.5mg was applied in the experimental group every other day 48 hours after operation to the end of the experiment, and the growth state of conjunctiva in both groups were observed. 2 HA implants from experimental group and control group respectively were extracted for testing the positive expression of VEGF by immunohistochemistry 3,7,14,21,28 days after operation.RESULTS: There was a significant correlation between HA implants fibrovascularization and the expression of VEGF. Histological examination confirmed that after 14 days, the experimental group HA significantly reduced inflammatory cell infiltration, immunohistochemistry showed that VEGF expression in the experimental group was significantly lower than that in the control group. CONCLUSION: It is closely related between HA implant fibrovascularization and inflammatory reaction; VEGF may be involved in the formation of fibrovascularization, dexamethasone may be through inhibiting the inflammatory response and VEGF expression, and thus inhibit implants of fibrovascular growth.
KEYWORDS: vascular endothelial growth factor; Hydroxyapatite; orbital implants; fiber vascularization; inflammatory response
0 引言
通常行球内容物剜除术或是眼球摘除术后若要保持眼球的原有形状，防止眼窝内陷，需向眼窝内植入相应大小的义眼台，羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)义眼台植入术是较理想的眼窝重建手术，通过植入义眼台能够较好的维持正常的眼球外观。但是部分患者由于自体或异体巩膜溶解坏死、结膜切口延迟愈合，导致义眼台暴露，其根本原因与植入物纤维血管化迟缓有关。目前对于植入物暴露缺乏有效的预防方法, 近年认为,新生血管的形成与炎症反应及多种细胞因子的调控密切相关。其中,血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和转化生长因子β1 ( transforming growth factorbeta 1, TGFβ1)备受关注。为了进一步明确二者在羟基磷灰石植入物纤维血管化中的作用及指导术后临床用药 ,我们用HA植入兔眼眶建立活体兔眼模型 ,并设立地塞米松干扰对照 ,检测VEGF与羟基磷灰石植入物纤维血管化形成的相关性;同时对激素抑制羟基磷灰石植入物纤维血管化的机制作进一步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
成年健康家兔20只(郑州实验动物中心提供)，体质量2.10～2.72kg，雌雄不限,实验前用裂隙灯显微镜检查双眼无疾病。随机分为实验组与对照组,每组10只;各组均采用HA植入物植入兔眼眶。术后滴妥布霉素滴眼液和球周注射地塞米松针的为实验组，术后滴妥布霉素滴眼液的为对照组。采用国产(北京金点睛科技有限公司，博奥普4000型)天然羟基磷灰石义眼台，眼台直径为22mm、孔径为200μm，质量4～5g。将其在生理盐水中浸泡5min后，从中央切成鼻侧和颞侧两半，分别小心用手术刀片将其加工制作成两个直径为7～9mm的球形HA，经高温消毒备用。兔抗血管内皮生长因子多克隆抗体 (000279R1,北京赛驰生物科技有限公司提供);妥布霉素滴眼液。手术均由同一实验者完成。用氯丙嗪25mg/kg和氯胺酮50mg/kg将兔全身麻醉。常规消毒铺巾,开睑器开睑;沿角膜缘环形剪开球结膜 ,分离筋膜囊 ,暴露眼外肌 ,将眼外肌分离并做预置缝线后剪断肌肉,剪断视神经后将眼球完整摘除,用纱布块置于眼窝内压迫止血约3min，将用塑料薄膜包裹的HA植入肌锥内;眼外肌对合缝合后,用5/0丝线间断缝合筋膜囊和结膜。结膜囊置凡士林纱条，1/0缝线缝合上、下睑。术后48h拆除兔上、下睑缝线 ,取出结膜囊凡士林纱条 , 术后两组滴妥布霉素滴眼液4次/d，此外实验组自术后48h起隔日球周注射地塞米松针0.5mg和至实验结束，并观察两组的结膜生长情况。
1.2 方法
术后 3，7，14，21，28d摘取2只HA植入物,将植入物切成鼻侧和颞侧两半,将颞侧半置于40g/L的甲醛液中固定,脱钙,石蜡包埋、切片、HE和免疫组织化学染色。
1.2.1 植入物纤维血管化
纤维血管化的程度由病理科医生进行判定 ,采用半定量方法计算纤维血管长入的情况,光镜下测定每个HA植入物标本的3∶00，6∶00，9∶00，12∶00方位的纤维血管长度 ,即纤维血管自 HA植入物表面长入球内的距离 ,取其4个数值的平均值 ,进行分级。HA植入物纤维血管化的分级:0级为 HA植入物球内无纤维血管长入,1级为纤维血管长度≤1.4mm，2级为纤维血管长度1.5～2.8mm;3级为纤维血管长度2.9～4.2mm，4级为纤维血管长度 4.3～5.6mm，5级为纤维血管长度≥5.7mm。
1.2.2 VEGF的表达
标本连续 4μm切片3张 ,脱蜡、水化 ,各组每个标本中均取1张 HE染色以肯定免疫组织化学所见到的形态学结果 ,其余 2张切片行免疫组织化学染色 ,步骤按试剂盒说明书进行 ,所有切片一次性完成。以组织内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准 ,按照染色程度的深浅可分为 5级[1]:0级()为细胞核和细胞间质不着色;1级(+)为标本内绝大多数细胞可疑阳性，少数细胞(<10%)可辨别为阳性;2级(++)为标本内大部分阳性细胞呈清楚可辨的棕黄色,但未达到3级;3级(+++)为细胞染色典型,呈鲜艳的棕色;4级(++++)为超过10%阳性细胞染色成棕黑色。
统计学分析：经SPSS 13.0统计学软件处理，采用相关性分析和t检验，取α=0.05进行统计学分析。
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