【摘要】 目的：检测一氧化氮(nitric oxide,NO)在缺氧性视网膜病变患者的玻璃体和血中的浓度变化，并与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)相比较，从而阐明两者的关系。方法：增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)16例，视网膜分支静脉阻塞5例，孔源性视网膜脱离11例和黄斑裂孔10例。抽取患者血液，并于玻璃体切除手术中抽取玻璃体。Griess反应检测NO的浓度，ELISA检测VEGF的浓度。结果：玻璃体中NO浓度在PDR组中明显升高(15.2，4.6～50.9μmol/L)，与其他3组相比具有统计学意义(P=0.0046);血液中的NO浓度在4组中无明显差异。玻璃体中的VEGF浓度在PDR(1507.2，50.7～3722.0mg/L)和BRVO(838.8，212.7～850.6mg/L)组中均明显升高，与其他两组相比具有统计学意义(P=0.0008)，而PDR组又高于BRVO组(P=0.001);各组病例血液中VEGF浓度无明显差异(P=0.76)。4组病例中，NO和VEGF间均未见相关性。结论：NO和VEGF在PDR组的玻璃体中均明显升高，表明二者参与了糖尿病视网膜新生血管生成的过程。
【关键词】 一氧化氮;血管内皮生长因子;玻璃体
Nitric oxide and VEGF expression in the ischemichypoxic retinopathy
Qiong Zhang1, ShiSheng Zhang2, Yan Yan1, YanHong Yao1, Xi Shen1, YingMing Zhou1, CaiHong Zhu1, JianMin Xu1
1Department of Ophthalmology, Ruijin Hospital of Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China;2New Vision Eye Clinic, Shanghai 200025, China
AbstractAIM: To evaluate the expressions of nitric oxide (NO) and VEGF in vitreous humor and blood samples in patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR) and in patients with branch retinal vein occlusion (BRVO) and to compare the levels with those of controls.METHODS: NO concentrations were determined using the Greiss reaction in plasma and vitreous humor samples. VEGF levels were assayed by ELISA. The patients in the studies were divided into four groups: 16 patients with PDR, 5 patients with BRVO, 11 patients with rhegmatogenous retinal detachment and 10 patients with macular hole.RESULTS: The vitreous fluid levels of NO were significantly higher in patients with PDR than those in other three groups (15.2，4.650.9μmol/L, all P<0.01). The concentration of VEGF were significantly higher in patients with PDR and BRVO than other two groups(P=0.0008，1507.2，50.73722.0mg/L; 838.8，212.7850.6mg/L respectively), but highest in PDR(P=0.001). There was no significance with NO and VEGF in serum in four groups. There was no correlation with that of NO and VEGF in four groups whatever in vitreous or plasma.CONCLUSION: The results suggest that higher levels of NO and VEGF may be related to the angiogenesis in DR.
KEYWORDS: nitric oxide; VEGF; vitreous
0引言
随着人民生活水平的提高、饮食结构的改变以及早产儿成活率的提高，缺氧性视网膜病变，如糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞等一些原本不受重视的眼底疾病已逐渐成为人们致盲的主要原因。缺氧性视网膜病变的共同病理改变表现为新生血管形成及血管过度化生。研究表明，在新生血管生成过程中，有诸多细胞因子参与其中。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种高度特异性血管内皮细胞有丝分裂素，它是目前公认与新生血管过度增生相关的重要因子。一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种重要的信使分子和生物活性物质，参与调节机体一系列生理活动[1]。有研究表明，在血管生成过程中，NO也参与了这个过程，并且和VEGF是起到相辅相成的作用。我们检测在缺氧性视网膜病变的患者眼中VEGF和NO浓度的变化，从而进一步证实NO和VEGF促新生血管生成的作用。
1材料和方法
1.1材料 200805/200910行玻璃体切除手术42例患者，其中增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy, PDR)16例;视网膜分支静脉阻塞(branch retinal vein occlusion, BRVO)伴玻璃体出血5例;孔源性视网膜脱离11例;黄斑裂孔10例。患者既往均无手术史、外伤史。玻璃体出血的时间均在3mo以上。其中PDR患者仅有玻璃体出血而无视网膜脱离。BRVO者也是单纯玻璃体出血的患者。所有患者术前空腹抽取静脉血，随即在4℃下离心(15 000r/min)5min，提取上清液，置80℃低温冰箱保存。患者在行玻璃体手术前，抽取术眼的未稀释的玻璃体液体1mL，随即离心15 000r/min，5min，提取上清液，置80℃低温冰箱保存。
1.2方法 用Griess法测定标本中NO的含量。采用双抗体夹心ELISA法检测样本中的VEGF的浓度。样本中的VEGF与酶标板上的抗人VEGF单抗结合，再与结合有生物素的抗人VEGF抗体结合，经辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，与酶底物反应染色，在450nm测定与VEGF浓度相对应的A值。以标准品的A值画出标准曲线，根据样品A值在该曲线图上查出相应的VEGF含量。
统计学分析：采用SPSS 10.0统计分析软件进行多样本均数方差分析及两两比较。P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1 NO浓度 玻璃体中NO浓度在PDR组中明显升高(15.2，4.6～50.9μmol/L)，与其他3组相比具有统计学意义(F=5.13，P=0.0046);血液中的NO浓度在四组中无明显差异(F=1.13，P=0.35)。
2.2 VEGF浓度 玻璃体中的VEGF浓度在PDR(1507.2，50.7～3722.0mg/L)和BRVO(838.8，212.7～850.6mg/L)组中均明显升高，与其他两组相比具有统计学意义(F=6.84，P=0.0008)，而PDR组又高于BRVO组(t=3.92，P=0.001);各组病例血液中VEGF浓度无明显差异(F=0.38，P=0.76)。在各组病例中，NO和VEGF均没有发现其相关性。
3讨论
NO是一种半衰期仅为数秒钟的自由气体，作为一种重要的信使分子和生物活性物质，NO参与调节机体的一系列生理活动，其中还涉及新生血管生成等病理过程[1]。已有研究表明NO在血管生成中起着促进或抑制作用。我们采用Griess法检测了糖尿病视网膜病变等患者玻璃体和血清中NO的浓度。结果显示在血清中NO的浓度在四组中无明显差别(F=1.13，P=0.35)。而在玻璃体中在PDR组中明显升高，与其它3组相比有临床意义(F=5.13，P=0.0046)。因此证实了NO在糖尿病视网膜病变中新生血管形成过程中起着促血管的作用。这与Hernández的研究结果相同[2]。视网膜分支静脉阻塞也是一种缺氧性视网膜病变，而我们没有检测到NO的浓度明显升高，可能是由于临床标本量太少，所以没有检测到。在血液中4组NO的浓度没有明显差异，提示玻璃体中NO并不是来源于血中NO的弥散。NO合成需要一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化。现已知至少有3种独立基因编码的NOS催化NO合成。神经元型NOS(nNOS)和内皮型NOS(eNOS)是结构型NOS(constitutive NOS)，主要参与神经介质传导和调节血管张力等过程[3];诱导型NOS(iNOS)主要表达于细胞因子或内毒素激活的巨噬细胞，所催化产生的NO是炎症和感染过程中重要的调节因子和效应物质[4]。在眼科领域，研究已经证明，内源性NO不仅是眼循环中有力的血管扩张剂，而且是内毒素诱导的前葡萄膜炎的重要媒介物，并与青光眼的发病机制有一定关系。iNOS在健康的组织内一般不表达或呈低表达，只有当机体出现病理情况下才大量表达。关于iNOS在血管形成方面的作用说法不一。iNOS抑制血管形成，而有的报道结果相反[5，6]。Hattenbach等[7]在老年性黄斑变性的患者中发现iNOS在脉络膜新生血管形成中具有举足轻重的地位。我们先前研究在OIR模型中也发现iNOS在缺氧2h时表达尤为明显，6h时开始下降，24h时回到接近正常水平。这提示了在缺氧早期，iNOS与VEGF一样立即出现明显的表达上调，是嗣后启动视网膜新生血管生成的早期分子事件，一定程度地促进了新生血管形成。并且通过运用抑制剂，进一步证明了iNOS作为促新生血管因子在视网膜新生血管中发挥作用[8]。由于在玻璃体中无法检测到iNOS的浓度，只能间接检测NO的浓度来证实其在视网膜新生血管形成中的作用。
VEGF是公认的促血管生成因子。我们发现，各组病例血液中VEGF浓度无明显差异(P=0.76)。玻璃体中的VEGF浓度在PDR组(1507.2mg/L)和BRVO(838.8mg/L)组中均明显升高，与其他两组相比具有统计学意义(P=0.0008)。提示了在缺氧性视网膜病变中VEGF的确是起到了促血管生成的作用。有很多研究也证实了这个结果[2，9]。我们的结果进一步显示，在PDR组中VEGF的浓度明显高于BRVO组的浓度(P=0.001)。这有可能有几种原因：(1)BRVO组的样本量太少;(2)VEGF在促新生血管形成中的作用大于NO的作用。这还需要进一步实验来证实。
在血管形成中NO和VEGF是密切相关的[10]。一方面，NO可以调节VEGF的合成：NO对VEGF的调节取决于NO产生数量的多少，少量的NO通过PI3KAkt通路上调VEGF的表达，其间也要通过HIF1和/或HO1调节通路;而大量的NO则抑制VEGF的表达，但具体机制尚不明了。另一方面，VEGF可以介导NO的合成：VEGF通过CaMAkt通路迅速合成NO;而NO延迟合成主要是通过PKC的激活。但是我们的研究结果未找到VEGF和NO有联系。这有可能和NO的样本量较少有关或者是VEGF主要在玻璃体内合成有关。我们的研究结果证实，NO和VEGF在缺氧性视网膜病变患者的玻璃体中均明显升高，尤其在糖尿病视网膜病变中，提示了两者参与了视网膜新生血管形成的过程。
【参考文献】
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10 Kimura H, Esumi H. Reciprocal regulation between nitric oxide and vascular endothelial growth factor in angiogenesis. Acta Bioch Polon 2003;50(1): 4959 |
