【摘要】 目的：研究豚鼠镜片诱导型近视眼视网膜、脉络膜及巩膜中RARβ的表达变化。方法：3～4周龄花色豚鼠50只随机分成3组，空白对照组10只，离焦Ⅰ组和离焦Ⅱ组各20只。Ⅰ组和Ⅱ组豚鼠左眼作为自身对照眼，右眼戴10.00D凹透镜，分别戴镜14，28d后除去镜片，建立近视离焦模型。镜片诱导型近视模型建立后分别处死实验组和对照组豚鼠，应用免疫组织化学、Western blot和RTPCR技术检测RARβ的蛋白和mRNA表达变化。结果：在豚鼠视网膜、脉络膜、巩膜内均有RARβ存在;RARβ蛋白及mRNA表达量在离焦组视网膜中明显增高(P<0.05)，而在脉络膜及巩膜中明显下降(P<0.05)。结论：RARβ可能参与豚鼠镜片诱导型近视眼的发生发展。
【关键词】 近视眼;豚鼠;视黄酸核受体β
Expression of RARβ in the lens induced myopia in guinea pig
HuiYu Lin, Bing Li
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001,Liaoning Province, China
Correspondence to:Bing Li.Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province,[email protected]
Received：20100618 Accepted：20100803
Abstract
AIM: To investigate the retinoic acid receptorβ(RARβ) expression in guinea pig eyes and study the relationship between the RARβ expression and experimental myopia.
METHODS: Fifty guinea pigs were randomized into the normal control group(n=10), defocusⅠgroup(n=20) and defocusⅡgroup(n=20). Guinea pigs in the defocus groups wore 10.00D lenses on the right eyes: defocusⅠgroup, wore lens for 14 days, and defocusⅡ group for 28 days. The left eyes didnt wear lenses as selfcontrol eyes. The refraction and axial length were measured before and after wearing lenses respectively. The protein expression of RARβ in retina was detected by immunohistochemisty and Western blot. RTPCR was used to observed the level of RARβ mRNA in retina.
RESULTS: Compared with the control eyes, the lensworn eyes of defocusⅠand Ⅱgroups became myopic and elongated(P<0.05, respectively), and the degree of myopia was lower and axial length was shorter in groupⅠthan those of groupⅡ(P<0.05). The protein expression and the mRNA level of RARβ in retina of the defocus groups increased significantly (P<0.05), while decreased significantly in choroid and sclera(P<0.05).
CONCLUSION: Expression of RARβ in guinea pig may play a role in the lens induced myopia.
KEYWORDS: myopia; guinea pig; retinoic acid receptorβ
Lin HY, Li B. Expression of RARβ in the lens induced myopia in guinea pig. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) 2010;10(9):16771679
目前常用的近视动物模型主要有两类，即形觉剥夺型近视(form deprivation myopia, FDM)和镜片诱导型近视(lens induced myopia, LIM)[1]。这两种近视眼动物模型都说明屈光状态的发育依赖视觉，视觉环境异常可促使视网膜释放一些信使来影响眼球生长。其中，视黄酸(retinoic acid, RA)[2,3]和视黄酸受体β(retinoic acid receptorβ,RARβ)[4,5]是调节实验性近视眼发生发展的重要信息分子，但作用机制尚不清楚。RARβ在哺乳动物LIM的作用报道较少。我们前期研究工作中已成功建立豚鼠离焦诱导型近视眼模型，戴10.00D诱导镜14d和28d分别诱导出(5.51±1.90)D和(8.69±2.46)D的相对近视，随戴镜时间的延长近视程度加深。在本实验中我们将研究RARβ在诱导眼中的表达变化，探讨RARβ的表达在哺乳动物镜片诱导性近视眼形成中的作用，从而为实验性近视发病机制的研究提供一条思路。
1材料和方法
1.1材料
选用3～4周龄健康三色豚鼠50只，雌雄不限，体质量180～220g，由辽宁医学院实验动物中心提供。YZ24带状光检影镜(苏州六六视觉公司)、US2000 A超仪(日本Nidek)、PCR扩增仪(英国Techne)、RARβ兔多克隆抗体(美国Santa Cruz)、兔Envision试剂盒(北京中杉金桥)、RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0(大连宝生物)。
1.2方法
将50只豚鼠随机分成3组，离焦Ⅰ组(n=20，右眼戴诱导镜，左眼不戴作为对照，诱导14d);离焦Ⅱ组(n=20，右眼戴诱导镜，左眼不戴作为对照，诱导28d);空白对照组(10只20眼，n=20，除检查外不做任何干预)。将10.00D诱导镜粘贴在豚鼠右眼周围皮毛上，作为离焦实验眼。饲养温度维持在20℃～25℃，湿度40%～60%，自然光照。白天隔2h观察豚鼠1次，如镜片脏，用棉签通过环形kt板镜框预留的小孔清洗镜片;如镜片脱落则及时固定。采用单盲法设计，所有检测人员均不知实验动物的具体分组和干预措施。图1豚鼠视网膜内核层RARβ蛋白的表达(Envision×400) A：Ⅱ组离焦眼强阳性(箭头);B：Ⅰ组离焦眼;C：空白组;D：Ⅰ组对照眼;E：Ⅱ组对照眼。
1.2.1 RARβ蛋白表达的检测
动物模型制作结束时，Ⅰ，Ⅱ组各随机选择5只豚鼠，空白对照组随机选择3只，深度麻醉处死，摘取眼球浸入40g/L多聚甲醛固定液中固定24h，组织脱水，石蜡包埋，5μm连续切片，切取眼球后极部组织，常规脱蜡至水，微波抗原修复，染色步骤按Envision试剂盒内说明书进行，一抗工作浓度为1∶50，用已知阳性表达片为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。应用CIAS1000细胞图像分析系统软件进行图片分析，每个实验组随机选取3张切片，每张切片随机选取5个有阳性表达的视野，对RARβ免疫组织化学染色结果进行平均灰度值的半定量检测，取其平均值。另Ⅰ，Ⅱ组各随机选择6只豚鼠，空白对照组随机选择3只，深度麻醉处死豚鼠，迅速摘取眼球，无菌操作，冰台上用显微剪沿角巩膜缘剪开，去除眼前段组织和玻璃体，快速分离出视网膜、脉络膜及巩膜组织，置于灭菌的1.5mL离心管中，标号液氮速冻后移入80℃冰箱冻存。取出冻存的视网膜、脉络膜及巩膜组织，加入细胞裂解液，充分剪碎组织后，匀浆。取蛋白样品20μg，进行SDSPAGE电泳分离蛋白质。转膜，封闭，加抗体(一抗和二抗浓度1∶1000)，洗膜，显色。GeneTools软件分析系统分析目的条带灰度值。
1.2.2 RARβmRNA表达的检测
提取总RNA：取出冻存的各组视网膜、脉络膜及巩膜组织，Trizol法提取总RNA。RARβ和豚鼠βactin引物如下：RARβ上游5’ACAC CACGAATTCCAGTGCT3’，下游5’AGGCAGATGGC ACTGAGAAG3’，扩增片段长度379bp;βactin上游5’G AGACGAAGCCCAGAGCA3’，下游5’CGAAGTCCAGG GCAACAT3’，扩增片段长度507bp，引物由上海生工生物公司合成。以提取的总RNA为模板反转录出cDNA，10μL反应体系。PCR扩增体系20μL，94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，28个反应循环，72℃最后延伸10min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后，凝胶分析系统摄像，经GeneTools软件分析图像并计算目的基因mRNA相对含量。图2RARβ蛋白电泳，1:离焦Ⅱ组实验眼;2:离焦Ⅰ组实验眼;3:Ⅰ组自身对照眼;4:Ⅱ组对照眼;5：空白对照组 A:视网膜;B:脉络膜;C:巩膜;D：actin。统计学分析:采用SPSS 13.0 for Windows行统计学处理，所有数据用±s表示，实验前后组内差异比较行配对t检验，组间差异行单因素方差分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 RARβ蛋白的表达
由于石蜡切片中脉络膜、巩膜组织脱片，免疫组化法只检测视网膜RARβ蛋白的表达情况。视网膜视细胞、内核层、神经节细胞的胞核阳性表达RARβ蛋白，呈棕黄色或棕色颗粒，其中以内核层表达最明显(图1)。Ⅰ组和Ⅱ组离焦眼、对照眼、空白对照组测得的内核层RARβ表达平均灰度值分别为152.24±4.93,145.19±5.18,165.25±5.32,166.45±6.12,163.00±4.95(测得的平均灰度值愈大表明蛋白的表达量愈小)。结果显示，Ⅰ组和Ⅱ组离焦眼内核层RARβ蛋白表达量增高，与对照眼及空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);Ⅱ组离焦眼内核层RARβ蛋白的表达量高于Ⅰ组(P<0.05)。另Western Blot法分析，与对照眼及空白对照组相比，RARβ蛋白在Ⅰ组和Ⅱ组离焦眼视网膜表达增强(P<0.05);而在离焦眼的脉络膜和巩膜的表达下调(P<0.05,图2)。Ⅰ组和Ⅱ组离焦眼RARβ蛋白表达也有差异，在视网膜中Ⅱ组比Ⅰ组表达强(P<0.05);在脉络膜和巩膜中，Ⅱ组比Ⅰ组表达少(P<0.05)。
2.2 RARβmRNA的表达
Ⅰ组和Ⅱ组离焦眼视网膜RARβmRNA表达增强，脉络膜及巩膜RARβmRNA表达减弱，与对照眼和空白对照组相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与Ⅰ组相比，Ⅱ组RARβmRNA在视网膜、脉络膜、巩膜中的变化更明显(P<0.05,图3)。
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