【摘要】 目的 研究高糖下腺苷A2A受体对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响。方法 体外培养人RPE细胞，应用免疫组化的方法检测腺苷A2A受体在人RPE细胞中的表达;用腺苷A2A受体作用培养的人RPE细胞，将其分为高糖(33 mM)+腺苷脱氨酶(ADA，2 U/ml)、高糖+ADA+腺苷A2A受体特异性激动剂(CGS21680，50 ?滋M)、高糖+ADA+CGS21680+腺苷A2A受体特异性拮抗剂(SCH58261，100 ?滋M)，药物组合刺激RPE细胞24 h后，裂解细胞提取RNA，同时收集细胞培养液，分别应用real-time PCR和ELISA的方法检测高糖下腺苷A2A受体对人RPE细胞VEGF mRNA和蛋白的影响。结果 腺苷A2A受体在RPE细胞中有表达，在高糖条件下，50 ?滋M CGS21680可以刺激RPE细胞VEGF mRNA水平升高约2.7倍，蛋白水平升高1.5倍，而再加100 ?滋M SCH58261反而使RPE细胞VEGF mRNA较前下降约40%，蛋白水平较前下降60%。结论 在高糖条件下，腺苷A2A受体可以刺激VEGF的合成，因此腺苷A2A受体可能参与糖尿病性视网膜病变新生血管的形成。
【关键词】 腺苷A2A受体;视网膜、色素上皮细胞;血管内皮生长因子
Effect of the A2A adenosine receptor on the expression of vascular endothelial growth factor under high glucose conditions in human retinal pigment epithelium cells
LU Runxia*， AN Jianhong*， CHEN Jiangfan， et al.
* Hospital of Ophthalmology and Optometry， Wenzhou Medical College， Wenzhou China， 325027
[Abstract] Objective To study the effect of the A2A adenosine receptor on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) under high glucose conditions in human retinal pigment epithelium (RPE) cells. Methods For cultured human RPE cells： immunohistochemistry was used to detect the A2A adenosine receptor in human RPE cells; cultured human RPE cells were treated with high glucose (33 mM)+adenosine deaminase (ADA， 2 U/ml)， high glucose+ADA+adenosine A2A receptor agonist (CGS21680， 50 μM)， high glucose+ADA+CGS21680+adenosine A2A receptor antagonists (SCH58261， 100 μM) for 24 h. After treatment， total RNA was extracted and cell culture medium was collected， real-time PCR and ELISA were used to measure the expression of VEGF mRNA and protein in human RPE by adenosine A2A receptor under high glucose conditions. Results A2A adenosine receptor expression as found in cultured RPE. The labeling was largely in the cytosol and membrane， but not in the nucleus. Under high glucose conditions， the adenosine A2A receptor agonist CGS (50 μM) stimulates an increase in the expression of VEGF mRNA (2.7 fold) and protein (1.5 fold)， while for the adenosine A2A receptor antagonist SCH (100 μM) in RPE cells, VEGF mRNA decreased by about 40% and protein levels decreased by about 60%. Conclusion Under high glucose conditions， the adenosine A2A receptor can stimulate the synthesis of VEGF. Therefore the adenosine A2A receptor may be involved in the formation of diabetic retinopathy neovascularization.
[Key words] adenosine A2A receptor; retinal pigment epithelium; vascular endothelial growth factor
糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是晚期糖尿病最常见的并发症也是极为严重的并发症之一，是一种影响视网膜血管完整性的微血管病变[1]。高血糖是糖尿病并发症发生和发展的重要危险因素，长期的高血糖症导致氧化酶损伤、微血栓形成、细胞黏附分子活化、白细胞郁积和细胞因子活化，继之，导致缺氧调节的生长因子的表达增加和细胞因子的产生，这些因子包括促血管生成因子和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞是眼内VEGF的重要分泌场所[1]。近年来，腺苷在糖尿病新生血管类疾病以及视网膜血管发育与缺氧损伤相关疾病中的作用越来越受到重视和关注[2]。因此，本研究的目的就是研究高糖条件下腺苷A2A受体对人RPE细胞VEGF表达的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 本研究材料取自角膜移植手术后的眼球剩余组织(来自自愿捐献眼球者，均无系统及眼部疾病史)。人眼RPE细胞培养：眼球摘除后24 h内用于细胞培养，方法参考文献[3]，建立人RPE细胞系，取3~8代RPE细胞用于实验。
实验所用药物：腺苷脱氨酶(ADA)，去除内源性腺苷的作用;腺苷A2A受体特异性激动剂(TOCRIS，1063，CGS21680)只作用于腺苷A2A受体而不作用腺苷其他受体(A1、A2B、A3);腺苷A2A受体特异性拮抗剂(TOCRIS，2270，SCH58261)。
1.2 方法
1.2.1 实验设计 取体外培养3~8代近融合的人RPE细胞，用含10%FBS的F12培养基配制单个细胞悬液，以50%接种在12孔培养板内，培养24 h，待细胞近融合状态时，换不含FBS的F12培养24 h，再次弃掉培养液，加干预。
1.2.2 实验分组 用腺苷A2A受体作用培养的人RPE细胞，将其分为高糖(33 mM)+ADA(2 U/ml)、高糖+ADA+CGS21680(50 ?滋M)、高糖+ADA+CGS21680+SCH58261(100 ?滋M)，先加入100 ?滋M SCH58261作用15 min，然后再加入CGS21680，以每并列3个孔为一组，药物均用不含FBS的F12来配制，在5%CO2、37 ℃ 恒温培养箱中培养24 h。
1.2.3 免疫组化检测腺苷A2A受体的表达 用4%PFA固定细胞，以SABC法检测腺苷A2A受体的表达。一抗采用1∶1000浓度(Santa Cruz)，免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新公司，于光镜下观察。
1.2.4 Real-time PCR检测RPE细胞中VEGF mRNA水平 用Trizol(invitrogen)法提取RPE细胞总RNA，然后用DNase Ⅰ(Promega)处理提取后的RNA以消除RNA中的DNA，上述RNA逆转录合成cDNA。然后将合成cDNA利用探针法进行Real-time PCR，检测VEGF mRNA表达水平的变化，引物序列如表1，扩增曲线如图1。
1.2.5 ELISA检测RPE细胞中VEGF蛋白水平的变化 收集实验组RPE细胞培养液，依照ELISA试剂盒(CHEMICON公司)进行操作，测定上清液中VEGF的浓度。
1.2.6 统计学方法 所有数据均输入SPSS for Windows(17.0)软件包，应用单因素方差分析数据。
2 结果
2.1 人RPE细胞表达腺苷A2A受体 免疫组化的结果显示，滴加腺苷A2A受体抗体的RPE呈阳性染色，细胞膜和胞浆呈棕红色颗粒，以PBS代替一抗的阴性对照细胞膜和胞浆都呈现蓝色，与阳性极易鉴别(见图2)，由此可以说明在RPE细胞膜和细胞浆中有腺苷A2A受体的表达，而在胞核中不表达。
2.2 高糖下腺苷A2A受体对RPE细胞VEGF mRNA的调节 高糖下加入2 U/ml ADA作为阴性对照，2 U/ml ADA +50 ?滋M CGS，2 U/ml ADA+50 ?滋M CGS+100 ?滋M SCH刺激RPE细胞24 h后，应用Real-time PCR检测细胞VEGF的mRNA含量，β-actin作为内参。50 ?滋M CGS单独刺激RPE细胞24 h后，VEGF mRNA的表达量升高将近2.7倍;50 ?滋M CGS联合100 ?滋M SCH刺激RPE细胞24 h后，VEGF mRNA的表达量反而较前下降约40%(见表2和图3)。ADA(HG)组与ADA+CGS(HG)组相比较，差异有统计学意义(F=13.050，P=0.0007，单因素方差分析);ADA+CGS(HG)组与ADA+CGS+SCH(HG)组相比较，差异有统计学意义(F=13.050，P=0.0007，单因素方差分析)。高糖下CGS可以增加VEGF mRNA的表达量，SCH可以抑制CGS作用所增加的表达量。
2.3 高糖下腺苷A2A受体对RPE细胞VEGF蛋白的调节 药物干预细胞后，应用ELISA检测上清液中VEGF的蛋白含量。高糖下加入2 U/L ADA作为阴性对照，50 ?滋M CGS单独刺激RPE细胞24 h后，VEGF蛋白表达量升高1.5倍;50 ?滋M CGS联合100 ?滋M SCH刺激RPE细胞24 h后，VEGF蛋白的表达量反而较前下降约60%(见表2和图4)。ADA(HG)组与ADA+CGS(HG)组相比较，差异有统计学意义(F=10.959，P=0.01，单因素方差分析)，ADA+CGS(HG)组与ADA+CGS+SCH(HG)组相比较，差异有统计学意义(F=10.959，P=0.01，单因素方差分析)。高糖下CGS可以增加VEGF蛋白的表达量，SCH可以抑制CGS作用所增加的表达量。
3 讨论
DR是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，视网膜新生血管是其主要的病理改变[1]。在DR发生和发展中，VEGF对新生血管的形成具有重要的调控作用[4-5]，且亦发现腺苷在调控新生血管形成中具有重要的作用，但主要集中在其他类型细胞在内毒素和缺氧条件下腺苷对VEGF调控的研究，而没有研究高糖条件下腺苷对VEGF调控。我们的研究明确在高糖条件下，腺苷A2A受体对人RPE细胞VEGF的调控，以便能更好地揭示在DR中腺苷对VEGF的调控作用。
腺苷(adenosine，ADO)是由ATP逐步脱磷酸化而产生的一种核苷，广泛存在于机体内，具有众多的生物学功能，通过G蛋白藕联的细胞表面受体A1、A2A、A2B和A3起作用[6-7]。腺苷A2A受体在眼部广泛表达，比如在鸡和哺乳动物的视网膜神经层有较多A2A受体分布[8-9]，视网膜色素上皮层也有分布[10]。我们的研究明确了在体外培养的人RPE细胞表达腺苷A2A受体，为更好地研究在高糖条件下腺苷A2A受体调控人RPE细胞VEGF提供理论依据。
在DR中，VEGF已经被认为是引起血-视网膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)破坏和新生血管形成的主要原因和关键因素之一[11]，因此，VEGF在DR中的作用越来越受到研究者的关注。RPE细胞起源于神经外胚层，是视网膜的重要组成成分，是眼内VEGF的重要分泌场所[1]。RPE细胞通过分泌VEGF保持脉络膜毛细血管高度血管化，保持其基底膜窗孔的高度渗透性，通过VEGF以自分泌方式诱导色素上皮衍生因子表达上调，使视网膜保持无血管状态，防止脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的形成和向视网膜下间隙发展[1]——由此可见，RPE在视网膜新生血管形成和发展的机制中起到重要的作用。
研究发现，腺苷在调控VEGF的表达上具有重要的作用，在多种类型细胞中给予腺苷或腺苷类似物/激动剂可提高VEGF的表达。例如，给予胶质瘤细胞不同剂量的腺苷可剂量依赖性地提高VEGF的表达[12];给予人视网膜内皮细胞10 μM NECA(腺苷受体激动剂)后可提高2倍VEGF蛋白的表达[13];用腺苷A2A受体特异性激动剂CGS21680可提高牛视网膜上皮细胞VEGF的表达;A2A基因敲除小鼠的巨嗜细胞可下调内毒素刺激下的VEGF的升高[14]——由此可见，腺苷A2A受体在其他细胞可以调控VEGF的合成。
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