|
2.2大鼠神经干细胞
胎鼠脑组织细胞悬液培养孔内可见培养48h后多数细胞团形成，折光性强，呈球形或者桑葚状悬浮生长(图1B)。培养至4～5d后，悬浮生长的细胞团数量增多，出现较大的细胞团，细胞团间可见融合现象。原代细胞培养至6～7d细胞团数量达到高峰。传代后48h形成新的与原代相似的细胞团。与RSC相比，其细胞团增殖速度较快。图3干细胞体外诱导分化为神经样细胞(IM×100) A:视网膜干细胞;B:神经干细胞。
2.3干细胞体外的诱导分化
取第2代RSC及神经干细胞应用含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液进行诱导分化, 3d可见大部分RSC贴壁生长，部分细胞开始长出小突起, 7～10d细胞突起逐渐增长成条状，呈典型的神经元形态(图3A)。第2代神经干细胞的表现与RSC相似，但其细胞形成突起更为明显，其具有神经元外观的细胞较RSC增多，且细胞之间连接成网状(图3B)。
3讨论
在以往的研究中，人们发现在部分脊椎动物的视网膜边缘，接近睫状体上皮的结合部存在着少量的RSC。在鱼和两栖类动物中，RSC可终生不断生长，持续产生前体细胞，在原有视网膜的周边产生新的视网膜，并可在视网膜损伤时增殖、分化以修复更新受损细胞。此外，人们发现在鸟类视网膜周边部的睫状边缘带也存在着不断增殖分化的RSC，但其产生新生视网膜的能力受到限制[1]。以往认为，哺乳动物中缺乏RSC，近年来的研究证实，胚胎鼠视网膜包含着在体外具有干细胞特性的祖细胞，这些细胞除可增殖并表达神经外胚层标记外，还具有多向分化潜能[2]，而且随着研究的不断进展，目前，研究者们已成功的从多种成年哺乳动物及人类的睫状体区域分离、培养出RSC。这些培养的细胞具有可自我更新、增殖的能力，在一定条件下可分化成为神经细胞、光感受器细胞等某些类型的视网膜细胞[36]，而且近年来研究证明经某些特定基因修饰后视网膜细胞将向特定类型的视网膜细胞分化[79]，RSC的研究进展为视网膜发育的具体机制研究及视网膜损伤疾病治疗带来了希望。
存在于睫状体色素上皮层的RSC由于数量少、部位隐匿,给分离、培养带来一定的困难。目前对RSC仍没有固定的分离培养方法，其培养条件多与脑源性神经干细胞相似，为了抑制干细胞分化常应用无血清培养基，常用的培养基为DMEM/F12(1∶1)。为保证培养细胞持续增殖、更新、保持去分化状态，还需要有丝分裂原(常用bFGF及EGF)。而且，还可添加培养神经细胞所需的多成分复合营养物质B27或N2以促进细胞生长。目前RSC的分离培养方法主要应用机械酶消化法，即先将组织剪成小块，再应用胰酶等酶类进行消化，最终得到单细胞悬液。但在酶消化过程中，为防止消化过程中细胞损伤，很难把获取组织块完全消化成单细胞，因此有时消化所获得的目的细胞较少。我们应用眼科微观剪刀将组织尽量剪成小块，直接置入培养皿内并加入培养基进行培养，避免了酶消化对于细胞的损伤，而且简化了操作步骤，减少了细胞的流失及实验污染的机会。培养48h即可发现较小的组织块周围开始不断有细胞迁移出来，而且在首次传代时用吸管吹打就可获得较多的单细胞，然后再用滤网过滤即可除去杂质，得到较为纯净的细胞团。本实验证明，应用组织块培养法从睫状体区分离、培养出的细胞团具有自我更新及增殖的能力，且免疫荧光法证实其与脑源性神经干细胞相似，均表达神经干细胞标记物nestin，传代后细胞的增殖潜能及nestin的表达无明显衰减。细胞在去除生长因子且存在血清的培养条件下与脑源性神经干细胞表现相似，可诱导分化成具有神经细胞形态的细胞，体现了其在一定条件下具有分化能力。因此，我们认为，组织块培养法适合于来源于睫状体区视网膜神经干细胞的分离培养，可以从少量实验标本中较为简单、快捷的体外扩增出大量的细胞数目以进行进一步的深入研究。
【参考文献】
1 Fischer AJ, Reh TA. Identification of a proliferating marginal zone of retinal progenitors in postnatal chickens. Dev Biol 2000;220(2):197210
2 David MC, Jim AR, James ET, et al. Survival and differentiation of cultured retinal progenitors transplanted in the subretinal space of the rat.
Biochem Biophy Res Commun 2000;268(3):842846
3 Tropepe V, Coles BL, Chiasson BJ, et al. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science 2000;287(5460):20322036
4 Coles BL, Ang nieux B, Inoue T, et al. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101(44):1577215777
5 Gu P, Harwood LJ, Zhang X, et al. Isolation of retinal progenitor and stem cells from the porcine eye. Mol Vis 2007;13:10451057
6 MerhiSoussi F, Angnieux B, Canola K, et al. High yield of cells committed to the photoreceptor fate from expanded mouse retinal stem cells. Stem Cells 2006;24(9):20602070
7 Jomary C, Jones SE. Induction of functional photoreceptor phenotype by exogenous Crx expression in mouse retinal stem cells. Invest Ophthalmol
Vis Sci 2008;49(1):429437
8 Xu S, Sunderland ME, Coles BL, et al. The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6. Dev Biol 2007;304(2):713721
9 Jomary C, Jones SE, Lotery AJ. Generation of lightsensitive photoreceptor phenotypes by genetic modification of human adult ocular stem cells with Crx. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010;51(2):11811189 上一页 [1] [2] |
