高玲 唐罗生 朱小华 胡蓉 张锟 王涛 刘桂欣
    中南大学湘雅二医院

    Kentucky Lions Eye Center, University of Louisville, USA
    Yongqin Liu*  Volker Enzmann*  Henry J Kaplan*  Dauglas Dean*       
 
    第一部分 小鼠视网膜内的VSELs

    背景: 在小鼠的骨髓内发现VSELs (Very small embryonic-like cells)。

    研究目的:
    1）探讨小鼠眼内是否存在VSELs。
    2）探讨VSELs在不同年龄小鼠眼内的变化规律。

    实验方法：
    1 小鼠：按照年龄把C57BL/6鼠分为新生鼠（出生后第3天）、成年鼠（出生后第3周）
    2  制备不同年龄鼠视网膜神经上皮（NSR）、视网膜色素上皮（RPE）、虹膜睫状体（CBI）单细胞悬液。
    3 免疫荧光染色和流式细胞仪分选small-sized (2~6μm)
Sca1+ Lin- CD45-
    4  提取细胞RNA
    5  采用real-time RT-PCR技术检测胚胎干细胞标记基因在不同年龄、不同组织Sca 1+ Lin- CD45- 小细胞的(2~6μm)中的表达情况。

    结果：  在新生鼠NSR中存在Sca 1+ Lin- CD45-小细胞的(2~6μm)，其胚胎干细胞相关的标记基因的表达水平与D3 ES 细胞相似，同时这些细胞还表达视网膜神经前体细胞的标记物Pax6，提示新生鼠NSR存在VSELs和已经部分分化的视网膜。

    第二部分 小鼠视网膜神经前体细胞

   研究背景：2000年Tropepe首次在成年小鼠睫状边缘区发现视网膜干细胞的存在；Young等从新生鼠的视网膜神经上皮分离出视网膜的前体细胞。

    研究目的：探讨从新生鼠或成年鼠的NSR、RPE、CBI培养的神经球的特点。

    实验方法：
    1、2同第一部分
    3 细胞培养 DMEM/F12 + N2+ bFGF
    4 提取培养细胞的RNA
    5 采用real-time RT-PCR技术检测在培养细胞中的胚胎干细胞、神经前体细胞、RPE前体细胞标记基因的表达。

    结果：
    1从新生鼠NSR、RPE、CBI均能培养出神经球。
    2 NSR神经球高表达神经前体细胞的标记物，提示为神经前体细胞。
    3 RPE组织形成的神经球中，MITF、RPE65 表达下调。

    第三部分 与色素脱失相关的基因表达

    背景：
    1 随着RPE传代的延续，色素颗粒逐渐丢失。
    2 MITF在RPE细胞的色素形成中发挥重要作用。
    3 RPE65是RPE成熟的标志。

    研究目的：探讨在RPE培养传代过程中可能致色素丢失的相关基因。

    实验方法:
    1 RPE细胞的培养    传代至第7代（P7）
    2 提取RPE组织、P7的RPE细胞的RNA
    3 采用real-time PCR的方法定量分析色素相关基因的表达。

    小 结
    1 胚胎干细胞标记物在新生鼠NSR分离的Sca1+Lin-CD45-小细胞中高表达，提示VSELs的存在。
    2 从新生鼠NSR成功地分离培养了视网膜前体细胞。
    3 Snail1上调可能是导致培养的RPE细胞色素丢失的相关基因。

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