关键词：组织工程 角膜细胞 壳聚糖 共混膜细胞 培养生物
第一章前言
1.1壳聚糖的基本性质
壳聚糖是由甲壳素在碱性条件下脱乙酞基后制得的一种能溶于酸性或碱性水溶液的高分子多糖。产品为白色半透明状、略有珍珠光泽。壳聚糖是一种聚阳离子多糖，在中性和酸性条件下带有大量的正电荷，具有抗菌、止血、整合金属离子等功能。壳聚糖的糖单元含有自由的氨基和多个轻基，比较容易进行化学修饰改性，如可以进行乙酞化、丁酞化、梭甲基化等。组织工程研究的主要热点是生物材料，壳聚糖及其衍生物作为性能优良的生物材料，近几年在人工皮肤、人工骨、人工软骨、神经修复导管、人工肝脏、人工角膜等组织工程产品研究方面己取得很大进展，有些己经取得可喜的成果并进入临床应用。随着皮肤组织工程的发展，现己研制出与自然皮肤更接近的壳聚糖双层人工皮肤。骨不连和骨缺损是目前临床治疗上的难题之一，目前多采用自体骨或异体骨移植进行修复。但可供移植的骨材料有限。利用组织工程学原理体外培养骨细胞体内移植是解决材料缺乏的一个重要途径，为解决这一问题提供了新的思路。这不仅可以减少自身骨移植的供区损伤，也可避免同种异体移植供体来源有限和不可避免的免疫排斥反应。目前骨组织工程的研究主要包括:1.种子细胞的体外培养。2.细胞种植支架材料的研究开发。3.组织培养中各种因子的调控作用。
1.2组织工程学的发展概况
组织工程学是以材料学、细胞生物学、分子生物学、医学等学科为基础的一门新兴的由多学科交叉的边缘学科。1987年，美国国家科学基金会正式提出了组织工程一词。(2003)则制备出8乙酸内酷一壳聚糖共混支架材料，包埋上PDGF-BB来诱导骨细胞生长，结果表明骨细胞在支架上可以很好的贴附和生长，培养一天后成骨细胞呈圆形，且伸出伪足;14天后细胞生长旺盛。Zhao等(2002)制备出轻磷灰石一壳聚糖一明胶三维支架，在其上培养鼠成骨细胞，利用组织化学、免疫组化以及电镜进行研究，结果骨细胞在支架上生长良好，有胶原和蛋白聚糖样的细胞外基质产生，培养三周后细胞一支架复合物有较好的生物矿化作用，这都说明了以壳聚糖为主要原料的复合支架材料可作为骨组织工程中细胞培养的支架和骨损伤修复的替代品。软骨没有血管，它的自我修复损伤能力十分有限。一旦受损伤很难愈合，会给患者带来极大的痛苦，而且目前在临床上软骨损伤修复相对也比较困难，所以软骨的组织工程学研究一直受到许多学者的关注。而且软骨组织工程是第一种获得成功的组织工程化组织。Lu等(1999)将壳聚糖溶液注射到鼠的关节软骨腔内，使膝关节软骨密度明显增加，说明壳聚糖有利于关节软骨损伤的愈合。根据壳聚糖溶液的pH依赖性，Chenite等(2000)开发出可注射溶胶、壳聚糖水溶液中加入多元醇盐如甘油磷酸二钠(GP)，在氢键、静电相互作用和疏水相互作用的协同下，壳聚糖溶液在生理pH条件下保持溶胶状态，而温度升至体温时则转变成凝胶(CS/GP)。牛关节软骨细胞与CS/GP溶胶复合后注射到小鼠皮下，3周观察到异位关节软骨形成，表明该可注射溶胶可用于软骨组织工程。
……………………
第二章不同壳聚糖共混膜的制备和性质研究
2.1不同壳聚糖共混膜的制备
壳聚糖是p(1-4)键合D葡糖胺残基和不同数目的无规N乙酞基葡糖胺残基组成的一种线性聚阳离子生物多糖，由甲壳素N脱乙酞基后制得。具有自由的氨基和经基，易于进行化学修饰改性而产生众多有活性的衍生物。壳聚糖及其衍生物作为功能材料在医药卫生*生物技术、日用化学品等方面己有较多的研究和应用。透明质酸(hyaluronicacid，HA)又名玻璃酸也是一种糖胺聚糖类物质，1934年美国Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。HA广泛存在于动物的各种组织细胞间质中，如皮肤、关节滑液、软骨、眼玻璃体、血管壁等。其中以关节滑液和眼玻璃体含量较高。HA在眼球玻璃体液和关节滑液和中起着润滑、防震和增稠剂的作用。本节测定了壳聚糖材料的脱乙酞度、粘均分子量、旋转粘度等指标，并制备出了不同的壳聚糖共混膜。
2.2流延成膜法制备的壳聚糖共混膜性质研究
膜片经酶液水解48hr，两种膜片都变薄，酶液中出现细小颗粒，随着时间的延长，颗粒变多变大，酶液变混浊。膜片的表面变得凹凸不平且透光性变差。三周后ch-cs膜片已经降解成大小不同的碎片，而ch-ha膜片则降解的更快，已经成为很小的碎片。一个月后，两种膜片基本上都己经降解完全。在干态下，比-cs共混膜片的结构比比-ha共混膜片的结构疏松，孔径大一些，但是由于ch-cs膜片的亲水性比ch-ha膜片的亲水性强，当膜片浸在溶液中时，膜片吸水溶胀，使孔径变小。Ch-cs膜片的溶胀程度要比ch-ha膜片大，从而使ch-cs膜片的通透性变得比ch-ha膜片的通透性稍差一些。综上所述，两种共混膜均有一定的亲水性、吸水性、结晶性，有很好的透光性，对于小分子物质和中分子物质具有一定的通透性，对牛血清蛋白有一定的吸附能力，在体外可被溶菌酶降解，说明两种共混膜在器官修复和组织工程中作为细胞培养的载体具有优良的生物相容性。
……………………
第三章角膜细胞与不同壳聚糖共混膜的生物相容性研究………31
3.1角膜基质细胞和上皮细胞的培养………31
3.2流延成膜法制备的壳聚糖共混膜与兔角膜细胞的生物相容性研究………37
第四章CaSO4处理后的壳聚糖一硫酸软骨素共混膜性质研究………40
4.1CaSO4处理的壳聚糖一硫酸软骨素共混膜的制备………42
4.2CaSO4处理后的壳聚糖一硫酸软骨素共混膜与兔角膜细胞的生物相容性研究……48
第五章壳聚糖共混膜的生物相容性试验………53
5.1共混膜的生物相容性的实验(肌肉) ………53
5.2共混膜的生物相容性的实验(眼内) ………5
第五章壳聚糖共混膜的生物相容性试验
5.1共混膜的生物相容性的实验(肌肉)
两种共混膜片植入新西兰兔肌肉7天后，观察到膜片己经断裂成几块，15天后，肉眼已经看不见膜片，30天后已经全部降解。肉眼观察组织无明显炎症反应。组织切片观察，可以看出丝线对照组中(见图23A)，丝线周围的肌肉细胞受损比较严重，巨噬细胞和嗜中性粒细胞很多并聚集在一起;而ch-cs共混膜组中，观察降解15天后的膜
片(见图23B)，可以看出膜片已经基本降解，仅有少量残余。紧靠膜片的肌肉细胞被有一定受损，出现自溶现象，但嗜中性粒细胞比丝线对照组要少很多，残余膜片四周的细胞完整，形态较好。而ch-ha膜片基本没有残留，观察降解15天后的膜片，可以看出膜片周围的肌肉细胞的自溶现象比较严重，看不到有细胞存在，但周围的巨噬细胞和嗜中性粒细胞也比较多。
……………………
结论
对壳聚糖一硫酸软骨素共混膜进行进一步改良，用不同量的CaSO;处理后对共混膜的透光性、含水量、通透性、对小牛血清蛋白的吸附性等性质进行了测定，发现这些性质都有了一定的变化，特别是通透性变大了，达到了试验的目的。通过以上的研究，筛选出了理想的组织工程化人工角膜的支架材料，并在材料上成功地培养了兔角膜上皮细胞和基质细胞，初步构建出了功能性角膜上皮细胞一支架复合物和功能性角膜基质细胞一支架复合物，特别是角膜基质载体材料的形成，对于组织工程化人工角膜的研究有着重要的实际意义。 |
