1.2方法 4wk NOD雌鼠随机分组。10wk始每周检测尿糖2次，发现尿糖强阳性后用血糖仪测血糖，连续2次血糖≥16.7mmol/L诊断为糖尿病。发生糖尿病的NOD雌鼠作为糖尿病（试验）组（n=10）。以同龄正常NOD雌鼠作为正常对照组(n=10)。分别在第4wk和12wk取糖尿病组和正常组小鼠2只，以摘除眼球法处死，置于30g/L戊二醛溶液中固定1～2wk。做超薄切片，醋酸双氧铀和枸椽酸铅双重染色。电镜下观察视网膜超微结构。分别在4wk和12wk取糖尿病组和正常组小鼠3只，以摘除眼球法处死，将眼球置于40g/L多聚甲醛固定，作石蜡切片（厚度为6μm），用TUNEL试剂盒检测，依照说明使用。同时设阴性对照和阳性对照（步骤同上）。电镜下凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞核内染色质高度盘绕，出现空泡结构为凋亡1期；细胞核的染色质高度凝聚、边缘化为2a期；细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体为细胞凋亡的2b期（晚期）。TUNEL法每个视网膜标本取3张切片，光学显微镜观察切片，细胞核呈棕黄色、棕褐色着染者为阳性。细胞核呈蓝色着染者为阴性。200倍光学显微镜下连续计数5个视野100个视网膜细胞数和染色为阳性的细胞数，并计算其占的百分比即凋亡率。

    统计学处理：所测数据以SPSS10.0统计软件包进行统计，采用双因素方差分析方法和t检验进行统计，以 P <0.05为统计学上具有显著性差异。

    2结果

    2.1电镜 正常组小鼠未见视网膜毛细血管基底膜，内皮细胞和神经节细胞明显异常。糖尿病4wk视网膜毛细血管基底膜增厚及血管周围组织水肿。内皮细胞染色质边集，伴细胞核变形。神经节细胞肿胀，核染色质分布紊乱,伴空泡变性。糖尿病12wk视网膜上述病变加重。毛细血管基底膜增厚明显，呈局灶结节样和迭片状增厚。内皮细胞核膜凹陷皱缩，核染色质凝聚靠边, 胞质向管腔突出,管腔变形。神经节细胞固缩，核膜皱缩、增厚，核染色质分布紊乱，线粒体嵴丢失。

    2.2 TUNEL法 正常对照组细胞凋亡少见。糖尿病组细胞凋亡主要发生在神经节细胞层和内核层的细胞。利用图像分析系统计数，发现糖尿病组视网膜细胞凋亡数目较正常组增多(P <0.01)，糖尿病12wk时视网膜细胞凋亡明显比糖尿病4wk时明显增加(P <0.01,)。

    3讨论

    糖尿病视网膜病变是糖尿病的严重并发症之一，可造成视功能下降及视力丧失，但糖尿病视网膜病变的发病机制尚不清楚。我们用TUNEL法和电镜检测早期糖尿病小鼠视网膜细胞凋亡情况。以往研究认为糖尿病主要损害视网膜微血管组织，在糖尿病的早期，死亡的视网膜细胞主要是毛细血管内皮细胞及其周围细胞[3，4]。目前研究认为糖尿病可损害视网膜神经组织[5，6]。我们发现在NOD小鼠糖尿病的早期凋亡就已发生。糖尿病4wk时视网膜神经节细胞层可见较多的凋亡细胞，而且在内核层可见少量凋亡细胞。糖尿病第12wk时神经节细胞层和内核层凋亡细胞明显增多，外核层也就可见凋亡细胞。由于凋亡主要发生在神经节细胞层和内核层的细胞，因此我们推测神经节细胞和内核层的双极细胞发生了凋亡或蜕变。电镜检查也显示糖尿病4wk及12wk小鼠视网膜神经节细胞的超微结构发生了改变，这些异常包括线粒体肿胀，线粒体嵴丢失、内质网扩张，核染色质分布紊乱，胞浆空泡化。其中线粒体改变是最重要的超微结构改变之一。视网膜神经节细胞的蜕变与凋亡可能有关，细胞线粒体改变和细胞凋亡发生在同一时间，提示二者存在一定的关系。线粒体是细胞氧化的空间，线粒体损伤会造成细胞氧化磷酸化失调，细胞生成ATP下降、损害细胞功能，甚至导致细胞死亡。糖尿病还可造成一系列能量代谢改变，影响视网膜细胞线粒体功能，最终导致细胞的凋亡。 而且线粒体释放出的细胞色素c和凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）是细胞凋亡路径的主要物质，因此线粒体的病理改变可能激发凋亡路径而导致视网膜细胞死亡[7]。

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