1材料和方法

    1.1材料 眶脂肪组织取自眼球萎缩行义眼座植入术的患者眼眶，共4例4眼，年龄38～45（平均42）岁。DMEM /F-12（1∶1）培养液、Ⅰ型胶原酶、油红O、地塞米松、异丁基甲基次黄嘌呤（IBMX）、转铁蛋白、泛酸钙、三碘甲状腺原氨酸（T3)、生物素、胰岛素购自Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；抗人CD29-PE、CD44-PE抗体购自北京晶美生物公司。培养基A：DMEM /F-12（1∶1），200mL/L胎牛血清，青、链霉素100mU/L。培养基B：DMEM /F-12(1∶1)，青、链霉素100mU/L，生物素33μmol/L，泛酸钙17μmol/L，人转铁蛋白10mg/L，胰岛素1μmol/L，T3 0.2 nmol/L。培养基C：培养基B内加入0.1mmol/L IBMX和1μmol/L地塞米松。油红O贮存液：称取0.5g油红O，溶于100mL异丙醇，60℃水浴30min充分溶解，4℃密封避光保存。油红O工作液：临用前取贮存液6mL，加入去离子水4mL，静置5～10min，分析滤纸过滤两次后于2h内使用。

    1.2方法 术中切取少量眼眶脂肪组织块，PBS漂洗3次，分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成分及血管，并剪成1mm×1mm大小组织块。若不能立即处理标本，加入PBS浸没脂肪组织块，4℃暂时保存，标本尽量在24h内处理。（1）组织法培养：将剪切的脂肪组织小块移入塑料培养瓶中。1h后，待组织块近干，缓慢加入少量（约1.5mL）培养基A。d4追加培养液约2mL，以后每3～4d换液1次。（2）消化法培养：向剪切的脂肪组织块加入适量（约3倍体积）1.5g/LⅠ型胶原酶，37℃消化1h（剧烈振荡）后，加入等量体积完全培养基中止消化，1 500r/min离心10min，弃上清，无血清培养基重悬，200目尼龙网过滤，再次离心 （1 500r/min，10min），弃上清，少量无血清培养基重悬，接种于玻璃培养瓶中，加入适量培养基A。待细胞生长近融合后，用2.5g/L胰酶消化传代。将细胞以4×107/L的密度传代接种于96孔板，每孔100μL。从d2起，每日取5孔，用MTT比色法检测细胞生长。以时间（d）为横坐标，各时相点吸光度的平均值（表示细胞相对数量）为纵坐标绘制细胞生长曲线。

    1.2.1细胞表面抗原的表达 收集生长状态良好的前脂肪细胞，调节细胞浓度为1×109个/L，向流式管中各加入调节好浓度的细胞悬液100μL，加入对应检测抗体CD29，CD44，并设置空白对照、同型对照。避光室温孵育20min。向管中各加入PBS洗液(PBS+10mL/L FBS+1g/L NaN3)2mL，轻轻悬起细胞，1 000r/min离心5min，洗细胞1次。弃上清，用PBS 500μL悬起细胞，上机（FACS流式细胞仪）分析。

    1.2.2诱导分化及鉴定 取6代以内生长状况良好的前脂肪细胞，以（3～5）×107/L的密度接种于96孔板中培养，待细胞生长融合，接触抑制2～3d后，改用培养基C进行诱导分化，4d后换用培养基B培养，之后每3～4d换液1次，13d结束分化。另每日取3孔，将培养的细胞用40g/L等渗甲醛固定1h，然后蒸馏水漂洗。加入油红O浸泡2h后，三蒸水漂洗数次。置于温箱中蒸发掉多余的水分后，加入异丙醇萃取，用紫外线分光光度计在波长为510nm处测量吸光度（A）。以时间（d）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制前脂肪细胞诱导过程中细胞内脂肪含量变化的曲线。

    统计学处理：数据以统计软件包SPSS 11.0处理。数据以均数±标准差( )表示。不同来源组间比较应用两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验，检验水准为0.05。

上一页  [1] [2] [3] [4] 下一页