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关键词：球后成纤维细胞；甲状腺相关眼病；IFN-γ；CD40
傅德生,许雪亮. CD40在人球后成纤维细胞的表达.国际眼科杂志,2007;7(3):698-700
0引言
甲状腺相关眼病（thyroid associated ophthalmopathy TAO）在病理组织学上特征性表现为眼眶组织内大量亲水性糖胺聚糖(glycosaminoglycan GAG)聚集和免疫活性细胞浸润[1,2]。免疫活性细胞产生的炎症介质能上调球后成纤维细胞（retroocular fibroblast RF）的目的基因，进而改变其生物合成活性，引起TAO的发生、发展。但免疫活性细胞浸润眼眶、免疫活性细胞和RF相互作用最终激活RF的分子机制尚不明确。RF与球后浸润的免疫活性细胞能否通过CD40/CD40L共刺激通路而相互作用，取决于RF是否表达CD40及球后局部微环境对CD40表达的影响。我们研究正常人和TAO患者RF是否有CD40mRNA的表达及rhIFN-γ对其表达的影响。
1材料和方法
1.1材料 RPMI1640，D-Hanks液，胰蛋白酶，EDTA由中南大学分析测试中心湘雅医学院中心实验室提供；rhIFN-γ（Peprotech EC LTD USA）；MTT（Sigma公司）；胎牛血清（丽欣生物公司）； DMSO（Sigma公司）。Trizol提取液 （Invitrogen公司）；DNA100标准物（宝生物工程有限公司）；RT-PCR试剂盒（宝生物工程有限公司）；PCR引物（宝生物工程有限公司）；DEPC（北京鼎国生物技术发展中心）；琼脂糖（北京鼎国生物技术发展中心）。PCR仪（Perkin Elmer公司），核酸纯度分析仪（美国Beckman公司），图像分析仪（美国Stratagene Eagle eyeⅡ）。TAO患者4例，均为男性，平均年龄49岁。按TAO眼部病变分级（NOSPECS）：5级2例，6级2例。患者行眼眶减压术时，取球后结缔组织。正常对照取自眼球萎缩半年内无任何眶内、眼内炎症及TAO表现，行眼球摘除义眼座植入术患者3例，男1例、女2例，平均年龄46岁。在手术过程中取球后结缔组织。无菌条件下用含有加抗生素培养基的带盖无菌瓶收集标本，在超净工作台内进行操作，取标本放入平皿，用无菌眼科剪剪下所需组织，去除上面的脂肪组织及凝血块，用无菌生理盐水反复冲洗，直至无血迹为止；将组织转到另一无菌平皿，并用D-Hanks液冲洗3次，剪成1mm3组织小块，将组织小块均匀分布铺于培养瓶的底壁上，加入200mL/L小牛血清的RPMI1640培养基（青霉素10mg/L、链霉素100mg/L），使液面刚能盖住组织块而又不致使组织块浮起。放置于37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育；48h后加培养基，以后每隔2～3d换培养基1次。
1.2方法
1.2.1浓度时间效应 分成6组，为不含rhIFN-γ的RPMI 1640阴性对照组及含rhIFN-γ的5组，分别是50、100、200、400、1000kU/L，孵育48h。另分成5组，为不含rhIFN-γ的RPMI1640的阴性对照组，含400kU/L rhIFN-γ的10％RPMI1640组，分别孵育12、24、48、72h。
1.2.2一步法半定量RT-PCR 取2～6代正常人或TAO患者RF按上述分组培养后，用胰酶消化离心, PBS洗涤后再次离心去上清，收集细胞。在含有细胞的Eppendorf管中加入Trizol试剂0.5mL，振荡混均，室温放置5min。加氯仿0.2mL，振荡混均，室温放置10min。4℃，12 000g离心15min，小心吸取上层水相，移入另一Eppendorf管中。加入等体积的异丙醇，振荡混均，室温放置10min。4℃，12 000g离心10min，弃上清。冰预冷的750mL/L乙醇漂洗沉淀；4℃，12 000g离心5min，弃上清。室温干燥10min，用适量的DEPC处理水溶解沉淀，150mg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，并测定A260，A280，计算RNA含量和纯度。CD40引物Forward Primer：5'-CTT CTT CCG ACC GTG ACA TGC-3'，Reverse Primer：5'-ATG GTT CGT CTG CCT CTG CAG-3'，扩增后DNA片段长330bp。GAPDH引物Forward Primer：5' -ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3' ，Reverse Primer：5' -TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'，扩增后DNA片段长452 bp。一步法RT-PCR反应体系及反应条件：总反应体系为25μL。模板1.0μL ，CD40上游引物1.0μL， CD40下游引物1.0μL，GAPDH上游引物1.5μL，GAPDH下游引物1.5μL，dNTP2.5μL， MgCI25.0μL，RNA buffer2.5μL， RNase Inhibiter0.5μL， AMV-RTase0.5μL，Taq DNA Polymerase0.5μL，DEPC水7.5μL。反应条件：50℃30min，94℃2min；变性94℃30s、退火58℃30s、延伸72℃60s，30个循环；最后延伸72℃5min。取扩增产物6μL与6×上样缓冲液1μL混合，加样。在含有5mL/L溴化乙锭（EB）的15mL/L琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE溶液，时间20～30min，电压为5V/cm。与标准分子量比较，鉴定扩增产物。PCR产物采用Eagle eyeⅡ图像分析仪进行半定量分析，计算单位为积分光密度。因内对照GAPDH与CD40的引物在同一反应体系中共同扩增，因此，无论影响PCR扩增产率的哪个因素改变，对两种产物的影响是一致的，两者扩增产量的比率在扩增反应中会保持一致，所应用GAPDH的吸光度值作为内对照，得出CD40mRNA表达的相对比值。本研究以CD40基因表达的相对比值进行统计学分析。
统计学处理：本研究计量资料用均数标准差( )表示，运用SPSS11.0 for Windows统计软件包进行方差分析，在此基础上进行单因素组方差分析，两两比较用LSD法检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
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