1 材料与方法 1.1 3T3成纤维饲细胞的准备 取Swiss-3T3成纤维细胞系细胞(珠海东大实验室提供),接种于50ml培养瓶中,加入细胞培养基(GIBCO) (Hams F12与DMEM1:1混合)培养。待细胞融合达90%,0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA 5ml消化成细胞悬液,以1:2比例重新接种传代。3T3成纤维细胞培养到对数期(约为70%—80%),取6瓶3T3成纤维细胞加入含有4.0μg/ml丝裂霉素C的细胞培养液后,分别作用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5小时,再加入新鲜培养液。24小时后,消化细胞以103个细胞/cm2接种于6孔板中。每2~3日换液一次。第2~12日,每日将3孔中的细胞消化,细胞计数取均值。 1.2 角膜缘干细胞克隆化培养及传代 新西兰白兔角膜缘内外2mm取材;将组织切成1mm~2mm大小,加入DispaseⅡ酶[4],置37℃、5%CO2恒温培养箱中消化3小时,再 加入0.25%胰蛋白酶(Difco)-0.04%EDTA常温下消化3~5分钟,稀释细胞为104个细胞/ml,取6块无菌6孔板(包括有盖玻片和无盖玻片两组),每孔各加1ml角膜缘干细胞稀释液(浓度为103个细胞/cm2)和1ml Swiss-3T3成纤维细胞稀释液(浓度为104个细胞/cm2),再补加1ml/孔培养液(Hams F12与DMEM的1:1混合物,20%胎牛血清)。接种48小时后,每日置显微镜下观察记录细胞贴壁情况, 每2~3天更换一次培养液,第4天开始每日记录克隆形成数,以每个细胞团超过4个细胞为1个克隆[5]。观察克隆生长情况,观察到细胞接种后第12日,细胞单层形成达80%时以0.04%EDTA去除Swiss-3T3成纤维细胞[6],继续传代培养角膜缘干细胞。 1.3 克隆化角膜缘干细胞的冻存和复苏 原代克隆化角膜缘干细胞消化成单个细胞后,常规方法冻存细胞[5],采用二甲基亚砜为冻存剂,-80℃冻存细胞,复苏前准备好饲细胞,接种角膜缘干细胞,检测细胞的CFE。 1.4 克隆化角膜缘干细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)染色 克隆化培养第3、6、9天,选取生长于盖玻片的兔角膜缘干细胞克隆细胞团各2张;同时选取培养第4天的有饲细胞和无饲细胞的角膜缘干细胞各2张,以0.04%EDTA去除饲细胞。常规间接免疫荧光染色,一抗为鼠抗兔增殖细胞核抗原单克隆抗体PC10(Calbiochem公司),荧光素FITC标记二抗羊抗鼠IgG,封片后荧光镜检并照相记录。 1.5 统计学方法 应用t检验、正态性检验等统计方法,设定P<0.05为有统计学差异。 2 结果 2.1 丝裂霉素C对Swiss-3T3成纤维细胞的影响 经4.0ug/ml丝裂霉素C处理不同时间的3T3细胞,形态较均一,24小时可贴壁,但在培养期间,其增殖能力不同。其中,丝裂霉素处理2.5小时的3T3细胞,培养期间细胞的形态及数量无明显变化(图1~3)。
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