3 讨论
   角膜上皮干细胞位于角膜缘处，周围是郎罕氏细胞和黑色素细胞构成的发育完善的上皮细胞“网缘”（rete ridges）即特殊的“Vogt”结构[7]。角膜缘干细胞是具有极强增殖潜能的细胞，在人工培养、损伤等条件下，较中央上皮细胞具有更高的增殖力[8]。角膜缘干细胞可以形成全克隆，并且可多次传代[9]。
   文献报道[10]饲细胞多选择经丝裂霉素C处理的Swiss-3T3成纤维细胞，证明其有助于促进兔角膜缘干细胞的生长和增殖。丝裂霉素C浓度的选择，多采用4.0μg/ml处理2小时[8]，Swiss-3T3成纤维细胞存活而且增殖能力较强。本研究发现，处理2.5小时的Swiss-3T3成纤维细胞在培养期间（约12日）数量无明显变化，说明其增殖能力已基本丧失，适合作培养兔角膜缘干细胞的饲细胞。在Swiss-3T3成纤维细胞为饲细胞条件下，兔角膜缘干细胞离体培养可形成克隆团,Swiss-3T3成纤维细胞有助于干细胞的生长和增殖。随着对培养环境的适应，细胞的增殖潜力明显高于无饲细胞层的角膜缘干细胞，同张胜等[11]的研究结果类似。冻存复苏后测定的角膜缘干细胞CFE显示，饲细胞组的角膜缘干细胞复苏率与无饲细胞组复苏率两者差异有统计学意义。由于细胞的复苏率较低，需要进一步研究新的细胞保存方法才能满足建立干细胞库和进行细胞实验的需要。
   增殖细胞核抗原（PCNA）是一种37KD的核蛋白。国外研究表明[12]，正常角膜组织中角膜缘基底细胞表达PCNA，是角膜缘干细胞的高增殖特性的标志。本研究显示类似结果：克隆化培养的角膜缘上皮细胞表达PCNA，是因为在饲细胞的共同作用下，角膜缘干细胞具有高增殖力，但仍保持了角膜缘干细胞的未分化特性。
   通过对不同时间角膜缘干细胞的克隆形成率和增殖细胞核抗原（PCNA）表达的分析，我们认为离体培养条件下，与饲细胞共同培养的的角膜缘干细胞比无饲细胞培养的角膜缘干细胞具有更高的增殖能力，适合进行角膜干细胞移植治疗角膜缘功能衰竭症，并可作为药物筛选的细胞模型。如果为干细胞提供更接近机体内环境的生长条件[13]如同种异体角膜基质膜[14]等，推测可获得更满意的结果。培养的角膜缘干细胞用于同种异体移植的体外条件尚有待于进一步优化完善。

参考文献
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2 潘志强, 张文华, 孙葆忱. 角膜干细胞增殖与分化表达实验研究[J]. 中华眼科杂志.1999, 35:19-21.
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4 Stenn KS, Link R, Moellmann G, et al. Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type Ⅳ collagenase[J]. J Invest Dermatol. 1989, 93:287-290.
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9 王颖，张文华，潘志强.角膜缘干细胞基础研究新进展[J]. 国外医学眼科学分册. 2002, 26：104-107.
10  Germain L, Auger F, Grandbois E, et al. Reconstructed human cornea produced in vitro by tissue engineering[J]. Pathobiology. 1999, 67:140-152.
11  张胜，陈家祺，郭琳洁, 等. 人胚胎成纤维细胞饲养兔角膜上皮和内皮细胞的体外培养[J]. 实验研究. 2001，19：432-435.
12 Gan L, Fagerholm P, Ekenbark S. Expression of proliferating cell nuclear antigen in corneas kept in long term culture[J]. Acta Ophthalmol Scand. 1998, 76:308-313.
13 Wessel H, Anderson S. TypeⅩⅡ collagen contributes to diversities in human corneal and limbal extracellular matrices[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997, 38:2408-2414.
14 Parnigotto PP, Bassani VB. corneal stroma and epithelium reconstructed in vitro[J]. Eye, 1998, 12:304-312.

文章来源：北京市眼科研究所  王颖 潘志强 张文华 武宇影 接英
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