作者单位：湖南中医药大学附属第一医院 眼科，湖南 长沙

    《眼视光学杂志》2008年1月10卷1期 文章

    【摘要】  目的 观察密蒙花提取物对去势所致的干眼症雄兔基础泪液分泌量，泪腺局部炎症因子转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影响，探讨密蒙花提取物抗雄激素水平下降所致的干眼症的作用机制。方法 将30只日本大耳雄兔随机分为空白组（A）、模型组（B）、1倍剂量密蒙花提取物治疗组（C）、2倍剂量密蒙花提取物治疗组（D）和染料木黄酮治疗组（E），每组6只，对B、C、D、E组行雄激素去势术建立动物模型，对C、D、E组分别以密蒙花提取物1倍剂量和2倍剂量以及染料木黄酮连续灌胃1个月，对全部实验兔行Schirmer I试验，采用免疫组织化学方法，对兔泪腺组织中炎症因子TGF-β1、IL-1β、TNF-α进行检测。结果 C、D、E组Schirmer I试验测量值明显高于B组（P<0.01），在泪腺导管及腺泡上皮细胞中，IL-1β、TNF-α阳性表达的细胞数均明显低于B组，而TGF-β1阳性表达的细胞数均明显高于B组（P<0.01）。以上检测结果C、D组均优于E组（P<0.05）。结论 密蒙花提取物中主要成分为黄酮类物质，可显著抑制雄激素水平降低后兔干眼症的发生。其作用机制可能与黄酮类物质化学结构与雄激素类似，可起到拟雄激素效应，从而调节泪腺局部炎症反应有关。密蒙花提取物可能成为治疗干眼症的新途径。

    【关键词】  去势 干眼症 泪腺 密蒙花提取物

    干眼症是指由于泪液的量或质的异常引起泪膜不稳定和眼表损害而导致的一组眼不适症状。眼部和（或）全身多种原因引起的泪腺特征性病理改变为泪腺组织灶性淋巴细胞浸润增殖，腺体组织进行性破坏，致使腺体分泌功能下降甚至丧失[1]。近年来国内外研究表明，性激素，尤其是雄激素；水平下降后，对泪腺调节作用异常，导致泪膜不稳定、局部炎症反应加重，最终导致干眼症。研究证明密蒙花花蕾中可分离得到8个黄酮类化合物，黄酮类化合物化学结构与雄激素类似，可能起到拟雄激素活性作用，在治疗性激素水平下降导致干眼症方面起到独到的效果。我们制作去势兔干眼症模型，测定其给药前后基础泪液分泌量、泪膜稳定性变化，对其泪腺组织标本进行局部炎症反应因子表达的研究，旨在探讨密蒙花提取物对抗性激素水平下降导致干眼症的作用机制以及治疗效果。

    1  材料和方法

    1．1  实验动物及分组  2月龄日本大耳雄兔30只，体重2.0~2.5 kg，由湖南中医药大学动物实验室提供。裂隙灯显微镜和眼底镜检查眼前节及眼底无异常，0.5%的卡因眼液表面麻醉后Schirmer I试验（Schirmer I test，SIT）≥10 mm/5 min和泪膜破裂时间（breakup time，BUT）≥10 s的动物方可使用。将这30只白兔随机分为空白组（A）、模型组（B）、1倍剂量密蒙花提取物治疗组（C）、2倍剂量密蒙花提取物治疗组（D）、染料木黄酮治疗组（E），每组6只。1．2  实验药物  密蒙花提取物干粉（湖南雅龙生物工程有限责任公司提供），制作方法是取密蒙花干燥花蕾20 kg，用70%乙醇提取两次，第一次加入8倍量，第二次加入6倍量，合并乙醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，将浓缩液真空干燥，粉碎。将粉末用乙酸乙酯提取三次，每次加入6倍量，合并乙酸乙酯提取液，常压回收乙酸乙酯，将浸膏真空干燥，粉碎即得。对照药物选用纯度98%的染料木黄酮干粉（湖南九汇现代中药有限公司提供）。

    1．3  主要试剂  5%BSA封闭液，山羊（或鼠）抗兔转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β），肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）多抗，生物素化山羊抗兔IgG，过氧化物酶标记链酶白卵素（Strept Avidin-Biotin Complex，SABC）免疫组织化学试剂盒，3，3-二氨基联苯胺（3，3-      diaminobenzidine，DAB）显色剂(以上试剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供)。

    1.4  实验方法  行双侧睾丸切除术（Orchiectomy，ORX）制作雄激素水平下降所导致的干眼症模型：将B、C、D、E四组实验兔手术切除睾丸及附睾。A组只切开阴囊，不切除睾丸，术后预防感染。A、B组每日以8.5 g/L生理盐水5 ml灌胃，C组每日以密蒙花提取物按体重50 mg/(kg·d)灌胃，D组每日以密蒙花提取物按体重100 mg/(kg·d)灌胃，E组每日以染料木黄酮按体重50 mg/(kg·d)灌胃。每组均灌胃4周。

    1．4.1  SIT检查基础泪液分泌量[2]  在给药前及最后一次给药后，SIT检查泪液基础分泌情况。方法是取5 mm×35 mm有刻度的试纸，一端反折5 mm，轻轻放入被测眼下结膜囊的中外1/3处，5 min后取出滤纸，测量湿长。一般≥10 mm/5 min为正常，模型组兔均≤9 mm，治疗组兔均≥10 mm。

    1．4.2  免疫组化法检测TGF-β1、IL-1β、TNF-α  的表达  每组兔均以空气栓塞法处死后立即取双眼泪腺组织，泪腺直径约4 mm，即刻将泪腺组织剪成大小两部分。较大的一部分予以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，每组石蜡块予以Shandon325型石蜡切片机连续切片，常规脱蜡至水，以免疫组织化学法检测TGF-β1、IL-1β、TNF-α的表达，显微镜观察，Motic B5显微摄像系统进行摄像。较小的另一部分予以2.5%戊二醛前固定。采用MIAS-1000型高清晰度彩色病理图文分析系统中的免疫组化测量系统。以2．105 μm为像素点长。在1．271×106 μm2窗口面积下测量炎症因子TGF-β1、IL-1β、TNF-α的平均光密度值，行半定量分析。并随机统计各组5~7个高倍视野(400倍)中的凋亡细胞总数，计算每高倍视野下的平均细胞数。

    1．4.3  电镜观察超微组织结构变化  每组样本从2.5%戊二醛固定液中取出后，以日立H-600透射电镜观察泪腺组织超微结构变化。

    1．5  统计学方法  用SPSS13.0软件进行统计分析。各组SIT测量值治疗前后比较，使用配对t检验；如不满足正态性，则使用符号秩和检验。SIT各组间治疗后比较，以治疗前测量值为协变量，使用协方差分析。各组炎症因子TGF-β1、IL-1β和TNF-α平均光密度的比较，使用多元方差分析。

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