【摘要】 目的 对一Leber遗传性视神经病变（Leber hereditary optic neuropathy，LHON）家系线粒体DNA（mtDNA）3个突变位点（第3460、11778、14484核苷酸）进行检测并分析。方法 采集该家系16名成员和1名非LHON家系正常对照的外周血5ml，提取总DNA，用聚合酶链反应（PCR）和限制性核酸内切酶酶谱分析技术，对mtDNA核苷酸位点（3460、11778、14484）进行突变检测。结果 该LHON家系成员mtDNA的ND4亚单位第11778核苷酸发生突变，而mtDNA的ND1亚单位第3460核苷酸和ND6亚单位第14484核苷酸未发生突变。结论 该LHON家系成员存在线粒体DNA点突变，mtDNA的ND4亚单位第11778核苷酸突变是本病的发病机制之一，PCR-限制性核酸内切酶酶谱分析技术为LHON的诊断提供了依据。
关键词 Leber遗传性视神经病变 线粒体 DNA突变 聚合酶链反应
The detection of mutation on mitochondrial DNA and analysis in leber hereditary optic neuropathy
Guan Weili，Yuan Guogang，Wang Yunxu，et al.
The First Hospital of Tongliao City Ke’erqin District，Mongolia Autonomous Region028000
【Abstract】 Objective To detect and analyze3mutations at np3460，11778，14484on mitochondrial DNA in a pedigree associated with Leber hereditary optic neuropathy.Methods The mitochondrial DNA of peripherial blood was amplified by PCR.After digestion of PCR producted by HinI1SfaN1and Sau3A1，we investigated if the mutation of miˉtochondrial DNA existed.Results The mutation at np11778was identified in most members of this pedigree while the mutation at np3460and14484were not identified in all the cases.Conclusion The members with Leber hereditary opˉtic neuropathy have a point mutation in mtDNA and the mutation at np11778is one of mechanisms inducing this disease.PCR technique provides a useful diagnostic aid for LHON.
Key words leber hereditary optic neuropathy mitochondria DNA mutation polymerase chain reaction Leber
遗传性视神经病变（Leber hereditary optic neuropathy，LHON）系一种主要累及视盘黄斑束纤维，导致视神经退行性变的遗传性疾病。其主要病因是线粒体DNA某些位点发生突变，是一种最为常见的线粒体遗传病。LHON的遗传特性为:母系遗传。笔者对一LHON家系16名成员及1名非LHON家系的正常对照者，应用聚合酶链反应（PCR）和限制性核酸内切酶酶谱分析技术 ［1，2］ ，进行mtDNA核苷酸位点（3460 ［3］ 、11778 ［4］ 、14484 ［5］ ）的突变检测，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 资料来源 本家系共26例，其中13例患病，已故者2例，其患病情况仅通过亲属了解。抽取其中16例家系成员外周血，设非LHON家系正常对照究室 1名。见图1（略） 注:LHON家系图:Ⅱ 2，3，4，6，7 ;Ⅲ 1，2，5，7，8，9，11，13，14 ;Ⅳ 1，4 为被采集血样标本者，≯先证者。 图1 家系谱
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 取研究对象新鲜血液5ml，ACD抗凝，用DNA提取试剂盒按常规方法提取DNA。
1.2.2 PCR 应用Pcrdesn软件系统，在第3460、11778 ［6］ 、14484这3个核苷酸位点的上、下游分别设计引物 ［7］ ，并对正常对照及16份标本进行PCR扩增。PCR反应在25μl体系中进行，反应液含:2.0μl（0.5μg）的模板DNA，5’端引物和3’端引物各1.5μl（30pmol），1.5μl（各3.75nmol）的dNTPs，2.5μl（62.5nmol）的MgCl 2 ，1μl（1u）的Tag酶，以及相应的缓冲液。PCR反应条件如下:94℃预变性5min;94℃变性50s，50℃～55℃退火50s，72℃延伸50s，循环周期34次;最后，72℃延伸5min。
1.2.3 酶解 分别用3种限制性核酸内切酶HinI1，SfaN1及Sau3A1消化3组PCR产物。酶解反应在20μl体系中进行，反应液包括:5.0μl的PCR产物，1.0μl（1u）的限制性核酸内切酶，以及相应的缓冲液。酶解反应条件如下:37℃，2h。
1.2.4 电泳 2%琼脂糖凝胶中120V电泳30min，紫外线下观察，拍照，记录结果。
2 结果
2.1 第一组实验PCR产物及酶解产物电泳结果 正常对照和16份标本的PCR产物全部被限制性核酸内切酶HinI1消化为146bp和47bp两个片段。见图2。
2.2 第二组实验PCR产物及酶解产物电泳结果 除正常对照和6号标本的PCR产物被限制性核酸内切酶SfaN1消化为175bp和24bp两个片段外，其余15份标本均未被消化。见图3。
2.3 第三组实验PCR产物及酶解产物电泳结果 正常对照和16份标本的PCR产物全部被限制性核酸内切酶Sau3A1消化为98bp和19bp两个片段。见图4。
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