3 讨论

　　Leber遗传性视神经病变是母系遗传的一种视神经损伤性眼病，线粒体DNA突变被认为是LHON的特异性改变。1988年Wallace首先研究得出结论LHON的发生是线粒体DNA突变所造成的，第11778核苷酸G→A突变，此后，Johns DR又发现了线粒体DNA第3460核苷酸和14484核苷酸突变的存在。目前，国内外有关LHON的mtDNA突变报道共涉及25个位点，其中原发突变超过5种，大多数突变位于编码NADH脱氢酶亚单位的区域内，最常见的是11778/ND4（G→A） ［8～11］  、14484/ND6（T→C）（10）和3460/ND1（G→A） ［10］  ，超过95%的LHON患者主要是这3个mtDNA核苷酸之一发生突变的结果，其中第11778核苷酸突变约占全部的50%～52%。 本实验采用PCR-限制性核酸内切酶酶谱分析法，检测mtDNA有无突变存在，3限制性核酸内切酶HinI1，SfaN1及Sau3A1在所扩增的ND1、ND4和 ND6亚单位片段中，分别有特定的切割识别序列，如核苷酸未发生突变，则原有限制性核酸内切酶所识别序列存在，故PCR产物被限制性核酸内切酶由一个完整的片段被消化成两个片段;如核苷酸发生突变，则原有限制性核酸内切酶所识别序列不复存在，故PCR产物无法被上述限制性核酸内切酶所消化。限制性核酸内切酶SfaN1的识别序列是GCATC↓，其中黑体的G为第11778核苷酸，正常对照和6号家系成员的mtDNA经PCR特异性扩增后，用限制性核酸内切酶SfaN1消化呈现出175bp和24bp两个片段，而其余15份标本的mtDNA经PCR特异性扩增后，不能被限制性核酸内切酶SfaN1消化。实验结果说明，正常对照和6号家系成员的mtDNA存在着SfaN1的识别序列，而其余15位家系成员的这一识别序列丧失，则有mtDNA第11778核苷酸突变存在。同理，正常对照和16位家系成员的mtDNA经PCR特异性扩增包括第3460核苷酸和第14484核苷酸，产物片段用限制性核酸内切酶HinI1和Sau3A1消化分别呈现出146bp、47bp两个片段和98bp、19bp两个片段，实验结果说明，正常对照和16位家系成员的tDNA存在着HinI1和Sau3A1的识别序列，没有第3460核苷酸和第14484核苷酸突变。mtDNA呈母系遗传方式，由于受精时精子仅细胞核进入受精卵，合子的细胞质全部由卵子提供，因此父亲不能把他的mtDNA传给子代，而母亲则把她的mtDNA传递给子代。在本家系中，以先证者为例，先证者及其母亲是该家系的患者，有mtDNA第11778核苷酸突变存在，其外祖母已故，追溯病史也是该家系的患者，而6号成员是男性后代，他和正常对照一样不存在mtDNA第11778核苷酸突变，说明本家系成员的患病情况符合mtDNA的母系遗传特征。

　　家系中有发生mtDNA第11778核苷酸突变的正常成员，尽管他们没有发生眼病，但是他们却存在mtDNA第11778核苷酸突变，因此他们是携带者。在LHON家系中，野生型和突变型线粒体DNA分子可并存于同一个细胞内，而不同组织的细胞中野生型分子和突变型分子间的比例可相差很大，是否发病与特定组织中突变型分子所占比例是否达到一定的阈值有关 ［12］  ，所以有点突变的个体并非全都是患者，可以是携带者。目前认为，突变阈值达到60%才发生疾病的表达。通过本实验，证明了该LHON家系成员存在线粒体DNA点突变，mtDNA的ND4亚单位第11778核苷酸突变是本病的发病机制之一，此外，本实验方法为LHON的临床诊断和鉴别诊断提供了一个可靠的检测诊断依据。（本文图片见封三）

　　参考文献

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    12 朱斌，张丽珊，黄鹰，等.Leber遗传性视神经病三种组织间mt DNA基因型差异性的研究.中华医学遗传学杂志，1994，11（2）:85-88.

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