中华眼科杂志 2000年第1期第36卷 论著

作者：刘斌　朱秀安

单位：刘斌（北京医科大学第三医院眼科　100083）；朱秀安（北京医科大学第三医院眼科　100083）

关键词：视网膜变性；细胞凋亡；基因；p53

　　【摘要】　目的　研究遗传性视网膜变性视细胞凋亡的基因调控。方法　对出生后第13～60天的遗传性视网膜变性动物模型RCS（Royal College of Surgeons）大鼠视网膜，进行末端脱氧核糖核苷酸连接酶介导生物素dUTP末端标记（TUNEL）凋亡细胞检测、p53蛋白免疫组织化学染色、p53 mRNA原位杂交和RT-PCR。结果　RCS大鼠视网膜视细胞自生后第25天出现凋亡，第30～35天达高峰；视细胞凋亡初期，即生后第28～30天，视细胞内p53蛋白和mRNA水平均显著升高。RT-PCR亦显示，RCS大鼠视网膜在生后第25～35天时可见较多p53 mRNA扩增产物。结论　遗传性视网膜变性视细胞凋亡初期p53基因呈高表达，提示p53基因可能参与视细胞凋亡的调控

Photoreceptor apoptosis and p53 gene expression in inherited retinal degeneration of RSC rats

LIU Bin, ZHU Xiu′an.

　　（Department of Ophthalmology, Third Clinical School, Beijing Medical University, Beijing 100083, China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the gene regulation of photoreceptor apoptosis in inherited retinal degeneration. Method　The retinas of inherited retinal degeneration in animal models of RCS (Royal College of Surgeons) rats, ranging from 13^th to 60^th postnatal days in age, were studied by TdT-mediated biotin-dUTP nickend labeling (TUNEL) for apoptosis, immunohistochemistry for p53 protein, in situ hybridization and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for p53 mRNA. Results　The photoreceptor of RCS rats underwent apoptosis from 25^th postnatal day, and reached the highest level at 30-35^th postnatal days. At the early stage of photoreceptor apoptosis, the level of p53 protein and mRNA in photoreceptors increased significantly. RT-PCR also showed that there was more production of p53 mRNA at 25 to 35^th postnatal days in the retinas of RCS rats. Conclusion　P53 gene expression increases significantly at the early stage of photoreceptor apoptosis, indicating that p53 gene might play a role in the regulation of photoreceptor apoptosis in inherited retinal degeneration.

　　【Key words】　Retinal degeneration； Apoptosis； Genes,p53

　　遗传性视网膜变性是严重的致盲疾患，发病机制不清，且无有效的防治方法。Chang等^［1］认为,细胞凋亡可能是各种类型视网膜变性病变中视细胞死亡的共同病理途径。但目前对视细胞凋亡的分子调控机制认识甚少，尚未见某种基因或分子与视细胞凋亡调控直接相关的报道。p53基因是一种抑癌基因，可作为“凋亡基因”直接诱导细胞凋亡，在许多类型的细胞凋亡中发挥着重要作用。在研究视细胞凋亡过程中，p53基因表达对认识视细胞凋亡调控机制、寻找遗传性视网膜变性防治方法具有重要意义。

　　对人类遗传性视网膜变性的研究因受组织标本来源的限制，需借助动物模型。RCS（Royal College of Surgeons）大鼠是研究遗传性视网膜变性的经典动物模型，目前已确定此鼠视网膜病变主要以视细胞凋亡为主^［2］。我们于1997年5月采用末端脱氧核糖核苷酸连接酶介导生物素dUTP末端标记（TdT-mediated biotin-dUTP nick-end labelling，TUNEL）方法进一步确定视细胞凋亡的时间，用免疫组化、原位杂交和RT-PCR方法观察视细胞凋亡不同时期p53基因的表达，探讨p53基因与视细胞凋亡的关系，为进一步研究视网膜变性及视细胞凋亡的发生机制提供实验资料。

　　材料与方法

　　一、动物

　　取生后第13、15、20、25～45及60天RCS大鼠（美国Illinois大学眼科研究所惠赠，北京医科大学动物所饲养），各4～12只，雌雄不拘。12 h光照（65～76 L_UX）/12 h黑暗循环条件下饲养。同龄SD（Sprague-Dawley）大鼠作正常对照。

　　二、TUNEL检测^［3］

　　25％水合氯醛腹腔麻醉动物，常规方法制备视网膜组织石蜡切片。切片经脱蜡；水化；20 mg/L的蛋白酶K 100 μl消化组织，37℃，30 min；3％过氧化氢消除内源性过氧化酶，30 min；TdT酶反应液20 μl：1×TdT缓冲液,TdT 0.3×10⁶ U/L,Bio-11-dUTP 0.01 mmol/L（美国Promega公司）；混匀后置37℃，4h；枸橼酸缓冲液终止反应，20 min；正常马血清封闭，20 min；亲和素辣根过氧化酶复合物（美国Vector Laboratories ABC试剂盒），1 h；DAB显色。常规封片。阳性对照片在TdT酶标记反应前用1 mg/L DNA酶I 20 μl水解DNA，37℃，30 min。

　　三、P53蛋白免疫组化染色

　　视网膜石蜡切片经脱蜡，水化；3％过氧化氢消除内源性过氧化酶，30 min；0.01 mol/L枸橼酸缓冲液修复抗原，置95～98℃，10 min；正常马血清封闭，20 min；兔抗大鼠p53蛋白多克隆抗体（美国Novocastra Laboratories公司）1∶100稀释，4℃，过夜；生物素标记的羊抗兔抗体1∶1 000稀释，室温下置1 h；亲和素辣根过氧化酶复合物（美国Vector Laboratories ABC试剂盒），1 h；DAB显色；Mayer苏木素复染；常规封片。

　　四、p53mRNA原位杂交

　　2 000 bp p53 cDNA裸探针按非放射性DNA探针标记方法进行地高辛标记；视网膜石蜡切片经脱蜡，水化；100 mg/L的蛋白酶K 100 μl，置于37℃，20 min；0.1 mol/L HCl，10 min；组织经70%，80％，90％，95％，100％酒精逐级脱水后晾干；每20 μl杂交液加1 μl标记探针，95℃变性3 min后，直接滴加到组织片上，封口膜覆盖，37℃，20 h；5×SSC，3×SSC，2×SSC，1×SSC逐级冲洗；地高辛缓冲液浸泡后加抗地高辛抗体（德国Boehringer Mannheim Gmbh公司），1∶500稀释，37℃，30 min；地高辛缓冲液冲洗；BCIP/NBT显色；晾干组织后封片。

　　五、p53mRNART-PCR

　　用Trizol抽提视网膜总RNA；紫外分光光度计测定RNA浓度；以mRNA为模板，oligo(dT)_12-18为引物，SuperscriptII逆转录酶合成cDNA（Life Technologies RNA逆转录试剂盒）：20 μl逆转录反应体系含1×PCR缓冲液，总RNA 3 μg，oligo(dT)_12-181 μl，2.5 mmol/L MgCl₂，0.5 mmol/L dNTP，10 mmol/L DTT,70℃变性后加Superscript Ⅱ逆转录酶200 U，42℃，50 min；70℃，15 min终止反应；加1 μl RNaseH消化RNA，37℃，20min。阳性对照管用试剂盒中提供的对照RNA代替组织中抽提的总RNA。阴性对照管反应体系中不加逆转录酶。

　　以逆转录合成的cDNA为模板，p53第6外显子为引物（5′-TATTCTTGCTCTTAGGCCTG-3′,5′-AGT-CTTCCAGCGTGATGAT-3）（北京医科大学病理室合成），TagDNA多聚酶的作用下扩增p53 mRNA的特定片断（232 bp）：50 μl PCR反应体系含1×PCR缓冲液，1.5 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L引物，0.2 mmol/L dNTP,Tag酶1 μl，cDNA 5 μl。PCR循环条件：94℃预变性，3 min；94℃，50 s；54℃，50 s；72℃，1 min；30个循环；后延伸15 min。以β-actin作为内参照（196 bp）。阳性对照管的模板用逆转录阳性对照管产物，并用相应引物。阴性对照管的模板用逆转录阴性对照管产物。5 μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

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