中华眼底病杂志 1999年第2期第15卷 论著摘要

作者：鹿庆　孙葆忱　王津津

单位：100730　北京市眼科研究所（鹿庆、孙葆忱）；北京同仁医院中心实验室（王津津）

　　关键词： 色素上皮，眼；眼损伤；细胞死亡；疾病模型，动物；细胞，培养的；聚合酶链反应；基因表达

　　中国图书资料分类法分类号　R339．144　　R773　　R446

　　为进一步从细胞和分子水平研究视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞氧化损害的机制，为临床防治与RPE细胞相关眼病提供理论依据，我们对氧化损伤的牛RPE细胞是否存在着凋亡以及p53基因表达水平的变化等进行了研究。

　　1　材料与方法

　　1．1　主要试剂　牛眼球购买于北京市清真食品厂，改良Eagle培养液（Delbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）（GibcoBRL公司），胎牛血清（天津血液研究所），鼠抗人p53单克隆抗体（北京天象人公司），辛基酚聚乙二醇醚（Triton）（Sigma公司），Tris（Serva公司），p53　cDNA探针（北京医科大学人民医院提供），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（北京原平生物技术公司）p53上游引物：5′-TTCCTCTTCCTGCAGTACT-3′（第5外显子），下游引物：5′-CAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3′（第6外显子）。

　　1．2　主要方法　①牛RPE细胞培养的方法与鉴定：参见Kelley的方法［1］。②RPE细胞氧化损伤模型制作：参考Augustin［2］的方法选择次黄嘌呤（hypoxanthine，HX）0．1　mmol／L，黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）5 U／L作为所有氧化损伤实验中HX／XO的标准浓度。③原位末端标记（TdT-mediated biotin-dUTP nick-end labeling，TUNEL）技术测定细胞凋亡：将传代牛RPE细胞用胰酶消化后，漂洗、离心，固定在载玻片上。加入末端脱氧核苷酸转移酶反应液，37℃，1小时，漂洗两遍。加入链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶（streptavidin-alkaline phosphatase，SA-AP）反应液，37℃，温育30分钟。硝基蓝四氮唑和5溴1氯3吲哚磷酸钠混匀后加在载玻片上，37℃温育30分钟。Tris液（pH7．5）、乙二胺四乙酸终止反应，显微镜下观察结果并照相。阳性凋亡细胞表现为细胞核有蓝紫色着色，显微镜下记数5个中倍镜视野中的阳性细胞总数，进行四格表资料的χ2检验。④免疫组织化学法测定p53蛋白表达：将传代RPE细胞用无水乙醇固定10分钟，Tris液（pH7．6）冲洗两遍，晾干。滴加一抗，4℃过夜，Tris液冲洗，37℃二抗孵育60分钟，Tris液冲洗，辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素孵育60分钟，Tris液冲洗，3，3-二氨基联苯胺显色，苏木素复染，脱水，甘油封片，　在中倍镜下观察。p53蛋白表达阳性表现为细胞核呈棕黄色着色，否则为阴性。⑤原位杂交法测定p53　mRNA表达：将传代的细胞用胰酶消化后，离心，弃上清液，涂片，37℃烘干，2％多聚甲醛与2％戊二醛固定，平衡盐溶液漂洗两次，加入蛋白酶K，37℃10分钟，2％多聚甲醛与2％戊二醛再固定1分钟，平衡盐溶液洗两次，70％乙醇，90％乙醇，无水乙醇各5分钟。0．2　ng／μl的标记探针和20％硫酸葡聚糖甲酰胶溶液涂在玻片上，100℃烘烤5～8分钟，0℃，氧钒核苷复合物混匀涂在玻片上加盖玻片，40～42℃湿盒过夜，缓冲液冲洗，阻断液室温15分钟，SA和AP37℃，30～40分钟，底物缓冲液洗三次，硝基蓝四氮唑和5溴1氯3吲哚磷酸钠滴片，37℃，置于湿盒1．5～2．0小时，0．5％核固红复染，双重蒸馏水冲洗，晾干，观察。细胞浆内出现蓝紫色颗粒或絮状物者为阳性，否则为阴性。为能定量观察RPE细胞p53蛋白和mRNA表达的情况，分别在显微镜下数6个中倍镜视野中的阳性细胞数，进行四格表资料的χ2检验。⑥逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT，PCR）分析：取培养瓶中的RPE细胞约4×106，利用异硫氰酸胍法提取总RNA［3］，按PCR试剂盒说明进行PCR扩增。按下述条件扩增35个循环，94℃变性45秒、55℃退火45秒、72℃延伸45秒，35个循环后，72℃后延伸60秒。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，溴乙锭染色后在长波紫外线下观察并照相，有300碱基对（bp）带者为p53　mRNA表达阳性。

　　2　结果

　　2．1　原位末端标记技术测定细胞凋亡　在原位末端标记的牛RPE细胞涂片上，可见细胞核中有蓝紫色的颗粒状沉淀，形态不一，有的核全染，有的染成半月形，有的成环状。正常对照组与HX／XO组阳性细胞数分别为10、150，二者比较差异有显著性（P＜0．01）。

　　2．2　测定p53蛋白和mRNA表达结果　免疫组织化学染色后，在正常对照组中，未发现p53蛋白呈阳性的细胞，在HX／XO组中，p53蛋白阳性的细胞数为154。在进行原位杂交的RPE细胞涂片上，HX／XO组中p53　mRNA表达阳性的细胞数为143，而在正常对照组中，p53　mRNA表达阳性的细胞数为22。HX／XO组与正常对照组表达p53蛋白和p53　mRNA阳性细胞数相比较，差异有显著性（P＜0．01）。

　　2．3　RT-PCR法测定P53　mRNA表达的结果　为了进一步证明p53表达水平的变化，利用PCR技术对p53　mRNA表达进行了定量测定，HX／XO组RPE细胞p53　mRNA表达的辉度值为2．338，高于正常对照组p53　mRNA的水平（辉度值1．239）。

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