中国中医眼科杂志 1999年第3期第9卷 综述

作者：钱勇　高健生　张励

单位：中国中医研究院眼科医院(北京100040)

关键词：视网膜内皮细胞培养

　　摘要　综述了视网膜微血管内皮细胞的体外培养过程和影响因素，对明确某些视网膜病的发病原因、预防和治疗具有重要意义。

The culture of retinal microvessels endothelial cells in vitro

Qian Yong, Gao Jiansheng，Zhang Li.

　　Eye Hospital, China Academy of Trad itional Chinese Medicine, Beijing 100040, China

　　Abstract The literature on the processes and influence fa ctors of retinal microvessles endothelial cells cultured in vitro, It is importa nt for us to clarify the etiology, prevention and treatment of some retinal dise ases.

　　Key words retina endothelial cell culture

　　视网膜病是一类导致失明的严重眼病，由于其发生、发展机制复杂，目前治疗方法有限而且疗效不佳，因此视网膜病成为困扰眼科界的一大难题。近年来生物医学的飞速发展，尤其是细胞生物学和分子生物学的发展，推动了对视网膜病的更深一步的认识。其中体外培养视网膜内皮细胞的成功和广泛应用对视网膜新生血管发生的机理有了重新认识，如通过对体外培养视网膜内皮细胞各种实验，发现许多肽类和非肽类生长因子和新生血管形成密不可分，并试图利用抑制生长因子产生或表达的药物来治疗视网膜新生血管^〔1,2〕。同时由于视网膜血管内皮细胞体外培养的影响因素很多，仍在不断改进其体外培养方法，就近年来国外有关体外培养的过程和影响因素作初步简述。

　　1　视网膜和视网膜微血管的分离

　　视网膜一般来源于牛眼^〔3,4〕、人眼^〔5,6〕，牛眼来源广泛、便宜，眼球大，容易分离出含视网膜血管的纤维层，因此成为最多选用的材料。人眼来源于自愿捐献的健康人群，没有年龄限制。一般在48h内分离出离体眼球视网膜，分离后的视网膜经缓冲液漂洗后在均浆器中制成视网膜均浆，以备过滤用。

　　过滤的目的是分离视网膜微血管，为得到纯化的视网膜血管内皮细胞做准备。目前较多采用两次尼龙筛过滤，尼龙筛孔径分别为53μm和88μmMeezan等发现孔径220μm尼龙筛过滤后视网膜大的血管网都能保留，而选用孔径86μm尼龙筛过滤仅保留小的血管网^〔3,7〕。视网膜血管内皮细胞体外培养为避免其他细胞的污染应尽量仅保留小的血管网。

　　2　细胞的分离

　　目前多种消化酶用于消化过滤后的视网膜均浆，以达到初步分离细胞的目的，其中有胶原酶和胰蛋白酶。一般在原代培养中使用胶原酶，Ⅰ、Ⅱ型均可^〔8〕。胶原酶消化后得到的细胞数较多，但会混杂周细胞、平滑肌细胞等，而胰蛋白酶对细胞有毒性作用不利于细胞的培养，因此不适合原代培养时用来消化视网膜均浆^〔9〕。在视网膜内皮细胞原代培养中使用胶原酶消化所需的时间和深度由于步骤、材料不同而不等^〔10,11〕。在传代培养中普遍采用胰蛋白酶是因为原代培养中内皮细胞的生长呈菌落样相互融合的细胞群，胰蛋白酶消化后会形成单个细胞以便进一步传代培养，同时胰蛋白酶还能降低非内皮细胞的贴壁能力^〔9〕。

　　仅有消化酶的作用是不能得到纯化程度很高的视网膜血管内皮细胞，为进一步纯化视网膜内皮细胞，可采用不同的方法^{〔12～14〕}，但最成功的方法是使用密度梯度沉降法^〔12〕和荧光素活化的细胞拣出计^〔15〕。密度梯度沉降法常用的介质是Percoll，经分离后可以得到纯化程度很高的内皮细胞^{〔12，15〕}。使用荧光素活化的细胞拣出计是通过荧光标记乙酰化低密度脂蛋白(AC-LDL)的作用，利用AC-LDL进入内皮细胞可以被溶酶体降解，并积累在溶酶体膜上，且内皮细胞降解AC-LDL以一个相当高的速度，与其他细胞如平滑肌细胞之间有显著差别的原理，来达到分离细胞的目的^〔16〕。荧光标记是用加入1-二甲基氨基-5-磺酰氯荧光素标记的方法。这种分离细胞的方法对细胞培养没有任何影响，并且具有3个优点：首先在标记时只有内皮细胞被完全标记，而且有很好的再现性；其次在标记过程中不需要细胞被固定；最后在纯化培养时，即使经胰蛋白酶消化染色也不消退^〔15〕。只是这种仪器(如流式细胞计)十分昂贵，不如密度梯度沉降法简便。

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