摘　要：目的:研究反复-70℃冻融对人眼脉络膜黑色素瘤OCM-1细胞中肿瘤干细胞的杀伤作用.方法:复苏OCM-1细胞,使用标准DMEM/F12培养基培养后,改用无血清化学限定培养基(serum-free medium,SFM)培养,并分离纯化肿瘤干细胞(choroidal melanoma stem cells,CMSCs).分别对OCM-1和纯化的CMSCs反复-70℃冻融后,MTT比较杀伤比率的差异.光镜及共聚焦显微镜观察细胞形态学改变.结果:在标准DMEM/F12培养基中贴壁生长的OCM-1细胞,使用SFM培养基培养后,贴壁细胞明显减少,第6代的CMSCs细胞,均为悬浮团状集落生长,呈现典型的干细胞生长方式,CD133阳性比率达到79.8%,Musashi-1强阳性表达.MTT比色法显示,反复-70℃冻融对OCM-1和CMSCs的杀伤比率存在显著差异.光镜及共聚焦显微镜观察发现,冻融后OCM-1细胞出现大量的凋亡细胞,而CMSCs则以坏死为主,凋亡细胞少见.结论:反复-70℃冻融对分化良好的OCM-1细胞主要是诱导其凋亡.而OCM-1中存在的肿瘤干细胞CMSCs对冷冻更加敏感,冻融后大量死亡,这是肿瘤在冷冻治疗后发生退变消失的根本原因.

关键词：脉络膜黑瘤;肿瘤干细胞;反复冻融(6):1278-1282

Study on lethal effect of tumor stem cells in human choroidal melanoma OCM-1 cell line by repeating -70C freeze thawing in vitro

Bin Liu　 Yong-Ping Li　 Wen-Xin Zhang　 Zhan Peng　
 
基金项目：中国国家自然科学基金资助项目(No.39870801,30672276);中国广东省社会发展攻关项目(No.2003A3020302)
作者简介：刘斌,男,中山大学中山眼科中心2005级医学硕士.
作者简介：通讯作者:李永平[email protected].
作者单位：刘斌（510060,中国广东省广州市,中山大学眼科学国家重点实验室,中山大学中山眼科中心）　
　　　　　李永平（510060,中国广东省广州市,中山大学眼科学国家重点实验室,中山大学中山眼科中心）　
　　　　　张文忻（510060,中国广东省广州市,中山大学眼科学国家重点实验室,中山大学中山眼科中心）　
　　　　　彭展（510060,中国广东省广州市,中山大学眼科学国家重点实验室,中山大学中山眼科中心）　

参考文献：

[1]Reya T,Morrison SJ,Clarke MF,Weissman IL.Stem cells,cancer,and cancer stem cells.Nature,2001;414:105-111
[2]Galli R,Binda E,Orfanelli U,Cipelletti B,Gritti A,De Vitis S,Fiocco R,Foroni C,Dimeco F,Vescovi A.Isolation and characterization of tumorigenic,stem-like neural precursors from human glioblastoma.Cancer Res,2004;64:7011-7021
[3]Mueller AJ,Freeman WR,Folberg R,Bartsch DU,Scheider A,Schaller U,Kampik A.Evaluation of microvascularization pattern visibility in human choroidalmelanomas:comparison of confocal fluorescein with indocyanine green angiography.Graefes Arch Clin Exp Opthalmol,1999;237:4482-4561
[4]Fang D,Nguyen TK,Leishear K,Finko R,Kulp AN,Hotz S,Van Belle PA,Xu X,Elder DE,Herlyn M.Reversal of developmental restrictions in neural crest lineages:transition from Schwann cells to glial-melanocytic precursors in vitro.Proc Natl Acad Sci USA,2003;100(9):5229-5233
[5]Toma JG,McKenzie IA,Bagli D,Miller FD.Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.Nat Cell Biol,20013:778-784
[6]Sieber-Blum M,Grim M,Hu YF,Szeder V.Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle.Dev Dyn,2004;231:258-269
[7]Fernandes KJ,McKenzie IA,Mill P,Smith KM,Akhavan M,Barnahe-Heider F.Biernaskie J,Junek A,Kobayashi NR,Toma JG,Kaplan DR,Labosky PA.Rafuse V,Hui CC,Miller FD.A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells.Nat Cell Biol,2004;6:1082-1093
[8]Kayahara T,Sawada M,Takaishi S,Fukui H,Seno H,Fukuzawa H,Suzuki K,Hiai H,Kageyama R,Okano H,Chiba T.Candidate markers for stem and early progenitor cells,Musashi-1 and Hes1,are expressed in crypt base columnar cells of mouse small intestine.FEBS Lett,2003;535(1-3):131-135
[9]钟秀风,李永平,葛坚,黄冰,彭福华,杜建阳,林建贤,伍忠銮,刘敬波.人视网膜母细胞瘤肿瘤干细胞的分离培养.中国病理生理杂志,2006:22(6):1177-81
[10]Fang D,Nguyen TK,Leishear K,Finko R,Kulp AN,Hotz S,Van Belle PA,Xu X,Elder DE,Herlyn M.A tumorigenic subpopulation with stem ceil properties in melanomas.Cancer Res,2005;65 (20):9328 -9337
[11]Dean M,Fojo T,Bates S.Tumour stem cells and drug resistance.Nat Rer Cancer,2005;5 (4):275-284
[12]Morin J,Traore A,Dionne G,Dumont M,Fouquette B,Dufour M,Cloutier S,Moisan C.Magnetic resonance-guided percutaneous cryosurgery of breast carcinoma:technique and early clinical results.Can J Surg,2004;47(5):347-351
[13]Harvey C.Cryosurgery for prostate cancer.J Perioper Pract,2006:16 (3):132-133,135-137
[14]Maiwand MO.The role of cryosurgery in palliation of tracheo-bronchial carcinoma.Eur J Cardio-Thoracic Surg,1999; 15(6):764-768
[15]Veatal JC.Critical review of the efficacy and safety of cryotherapy of the prostate.Curr Urol Rep,2005;6(3):190-193
[16]Kerkar S,Carlin AM,Sohn RL,Steffes C,Tyburski J,Littrup P,Weaver D.Long-term follow up and prognostic factors for cryotherapy of malignant liver tumors.Surgery,2004; 136(4):770-779
[17]Powell T,Whelan C,Schwartz BF.Laparoscopic renal cryotherapy:biology,techniques and outcomes.Minerva Urol Nefrol,2005;57 (2):109-18
[18]Yan TD,Padang R,Xia H,Zhao J,Li J,Morris DL.Management of involved or close resection margins in 120 patients with colorectal liver metastases:edge cryotherapy can achieve long-term survival.Am J Surg,2006;191 (6):735-742
[19]Baust JG,Gage AA.The molecular basis of cryosurgery.BJU International.2005;95(9):1187-1191
[20]刘斌,李永平.深低温反复冻融对人眼脉络膜黑色素瘤OCM-1细胞内钙离子浓度的影响.国际眼科杂志,2006;6(5):1005-1007

 
收稿日期：2006年12月8日

修稿日期：2006年12月12日

出版日期：2006年12月25日