【摘要】 目的：观察CD81在正常大鼠视网膜色素上皮层（retinal pigment epithelium, RPE）的表达。方法：用抗CD81抗体EAT2对正常大鼠RPE组织切片及体外培养RPE进行免疫组织化学染色，H121对RPE组织进行CD81蛋白的Western blot分析。 结果：正常大鼠视网膜的色素上皮细胞膜表面呈CD81的阳性染色，体外培养的大鼠RPE也呈CD81阳性表达；Western blot分析RPE层蛋白出现CD81阳性条带。 结论：正常大鼠的RPE层可以表达CD81。
【关键词】 CD81 视网膜 大鼠
0引言
CD81是tetraspanins蛋白超家族的成员之一。作为一类特殊的膜表面蛋白，它们广泛表达于生物体内，参与信号转导系统，对细胞的粘附、激活、增殖和分化等行为进行调节，其中CD81已被证明是接触抑制过程的一个关键性介导因子，可以抑制多个类型细胞（包括视网膜的RPE和神经胶质细胞）的细胞增殖活性[1,2]。在视网膜的胚胎发育和创伤愈合过程中，密度依赖性细胞增殖抑制机制保证了视网膜内细胞的适度增殖。一旦这一生长限制性机制不能正常发挥，就可能导致发育过程中的过度细胞增生甚至引起肿瘤形成，或加重视网膜创伤及病变后的增殖性视网膜病变，损害视功能。因此，了解CD81在正常和损伤视网膜中的表达对于我们掌握视网膜的胚胎发育过程和创伤愈合机制有着不可忽视的意义，而至今只有Clarke 等[3]应用自己筛选出的抗CD81抗体进行过相关研究。我们应用正常大鼠视网膜的组织切片和体外培养视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium, RPE）观察CD81在正常大鼠视网膜RPE层中的表达模式。
1材料和方法
1.1材料
兔抗人CD81多克隆抗体(H121)、仓鼠抗小鼠CD81单克隆抗体（EAT2）、生物素化羊抗仓鼠IgG和FITC标记羊抗仓鼠IgG购自Santa Cruz公司，小鼠抗人角蛋白18单克隆抗体，生物素化马抗小鼠IgG，羊抗兔IgGHRP，罗丹明标记山羊抗兔IgG，罗丹明标记山羊抗小鼠IgG，SP试剂盒（SP9001），浓缩型DAB试剂盒等，购自北京中山生物技术有限公司。其它：DMEM（Dibco）、胎牛血清（PAA）、胰蛋白酶（Sigma）、胶原酶（collagenase CLS; Worthington Biochemical Corp.）、BSS（Alcon）等。冷冻切片机（ReichertJung 2800 FRIGOCUT），电转仪（BioRad），电泳仪（北京六一仪器厂），垂直电泳槽（BioRad），低温超高速离心机（Beckman），二氧化碳细胞培养箱（Costar），洁净工作台（北京半导体设备一厂），倒置显微镜（Olympus）等。健康成年雌性清洁级SpragueDawley (SD)大鼠（体质量150～200g）、SD裸鼠（出生3d）及Brown Norway(BN)大鼠（体质量约120g），无眼部疾患，常规喂养，中国人民解放军总医院实验动物中心提供。
1.2方法
SD大鼠3只，以100mL/L水合氯醛3.5mL/kg ip，全麻成功后40g/L多聚甲醛心脏灌注，摘除眼球，制作6μm厚视网膜冰冻切片，采用SP法染色，阴性对照组以PBS代替一抗（EAT2），部分切片苏木精复染。另将取自3只健康BN大鼠的RPE研磨至透明液态，加入细胞裂解液200μL，4℃ 30min。4℃ 5000r/min离心15min，取上清20℃保存。BCA试剂盒定量蛋白，取20μg样品蛋白经150g/L SDSPAGE凝胶电泳分离，湿式电转槽230mA转膜1h，10g/L BSA封闭1h。1∶500稀释一抗（H121）反应1h，PBST洗3次，每次5min。1∶20000稀释二抗（羊抗兔IgGHRP）反应1h，PBST洗3次，每次5min。加发光底物后X光片显影。大鼠RPE培养采用Edwards的方法[4]。细胞的免疫组化染色分别应用SP法和免疫荧光染色法。
2结果
正常大鼠视网膜冷冻切片中RPE细胞表面可见CD81阳性标记（图1）。应用非还原样品缓冲液，正常大鼠RPE的蛋白样品在26 kDa处出现阳性条带，加入还原性样品缓冲液后则不出现阳性条带（图2）。为了进一步确定大鼠视网膜中RPE是否表达CD81，我们进行了细胞培养。原代培养大鼠RPE细胞附壁后呈扁平多角形，富含色素颗粒(图3)，约3wk生长至融合。细胞传代后色素颗粒逐渐减少、消失。细胞形态转变为梭形及多角形。应用角蛋白及GFAP对第3代RPE进行免疫组织化学染色，结果角蛋白呈阳性表达（图4），GFAP则呈阴性。应用SP法和免疫荧光法对培养大鼠RPE进行免疫组织化学染色，结果发现CD81在RPE（图5）上呈阳性表达，表达部位位于细胞膜表面，在与其它细胞接触部位表达尤为显著。
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