【摘要】 确定黄酮对人角膜内皮细胞（human corneal endothelial cells, HCEC）的影响及其对因氧化损伤所致细胞凋亡的抗氧化保护作用。方法：利用体外培养的HCEC，通过添加不同浓度的黄酮继续培养，或经不同浓度黄酮预处理后再添加过氧化氢（H2O2）继续培养，采用光镜形态观察、吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术手段，研究黄酮对HCEC的影响及其抗氧化作用。结果：黄酮浓度高于85μmol/L时可诱导HCEC发生细胞凋亡，而低于70μmol/L时对HCEC没有影响；55和70μmol/L黄酮预处理对600μmol/L H2O2所引起的HCEC细胞凋亡具有显著的抑制作用（60%→22%，8%；P<0.01），而85和100μmol/L黄酮预处理对H2O2所引起的HCEC细胞凋亡没有显著的抑制作用。结论：55～70μmol/L黄酮对HCEC具有显著的抗氧化保护作用，而浓度高于85μmol/L的黄酮反而能诱发HCEC发生细胞凋亡。
【关键词】 人角膜内皮细胞 细胞凋亡 过氧化氢 黄酮 抗氧化活性
0引言
角膜内皮细胞是位于角膜后表面的一单层细胞，它将角膜中的水分持续“泵”至前房，对于维持角膜的半脱水状态、厚度及透明性具有重要作用。哺乳动物角膜内皮细胞在成年后便丧失分裂能力，局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞增大、扩展、移行来填补缺损区[1,2]。一旦角膜内皮细胞的密度低于维持其生理功能的临界值，角膜就会出现不可逆病变而致盲[3,4]。导致角膜内皮细胞损伤的因素还未完全查清，但越来越多的证据表明，活性氧自由基是导致其损伤的一个重要原因[5,6]。一系列动物及临床实验证明，活性氧自由基引起的角膜内皮细胞凋亡是多种角膜疾病的诱因[7,8]。因此，寻找有效的抗氧化药物对于预防和治疗此类角膜疾病具有重要意义。黄酮类化合物是一类广泛分布于植物界的天然抗氧化剂，是以黄酮（2苯基色原酮）为母体的一大类化合物的总称，也是许多中草药的有效成分，具有阻滞细胞周期、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等功效[913]，其中备受学者们关注的是其抗肿瘤活性和抗氧化活性。最近的研究结果表明，3,4′二羟基黄酮[14]、黄芩素等[15]多种黄酮类化合物均可抑制由过氧化氢（H2O2）引起的细胞凋亡。因此，黄酮类(flavonoids)化合物无疑是一种治疗氧化损伤所致角膜疾病的高潜质候选药物。由于人角膜内皮细胞（human corneal endothelial cell, HCEC）来源的局限性及体外培养建系的困难性，目前关于活性氧对HCEC影响及其预防及治疗措施的研究主要通过临床实验进行，耗资大、耗时多，在很大程度上限制了实验的范围及进程。我们首次利用HCEC的体外培养体系，选用不同浓度的黄酮单独或与H2O2相继处理HCEC，研究了黄酮对HCEC的影响及其对H2O2所致HCEC凋亡的抑制作用，旨在筛选出对细胞低毒且能高效抑制H2O2所致HCEC凋亡的使用浓度，为抑制或延缓HCEC凋亡的临床应用提供依据。
1材料和方法
1.1材料
人角膜内皮细胞（HCEC）来自本实验室自建的人角膜内皮细胞系（HCECfan）。胎牛血清为Hyclone公司产品，DL2000标准分子量DNA为Takara公司产品，黄酮（flavone）、蛋白酶K和RNA酶A为Sigma公司产品，DMEM/F12(1∶1)培养液干粉和胰蛋白酶为Gibco公司产品。黄酮用DMSO配成母液，过滤除菌后用DMEM/F12(1∶1)培养液稀释成工作液，DMSO终浓度不超过1g/L。预实验证实该浓度DMSO对细胞不构成毒害作用。HCEC用含有100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液在50mL/L CO2、37℃培养条件下进行常规培养。待细胞长满培养瓶底面后，用2.5g/L胰蛋白酶消化收集细胞，以1/2的比率接种于新培养瓶内，加入完全培养液5mL进行传代培养。
1.2 方法
细胞按上述方法接种培养24h后，分别加入终浓度为55，70，85和100μmol/L的黄酮于同样条件下继续培养。每组均取3个平行孔，以不加黄酮，其它条件相同的HCEC作为阴性对照。每隔2h于倒置显微镜下观察照相。
1.2.1黄酮预处理对H2O2所致HCEC凋亡的影响
细胞按上述方法接种培养24h后，分别用浓度为55，70，85和100μmol/L的黄酮预处理30min，再分别加入600μmol/L H2O2继续培养。每组均取3个平行孔，以不加黄酮和H2O2，其它条件相同的HCEC作为阴性对照，以不经黄酮预处理直接加入600μmol/L H2O2，其它条件相同的HCEC作为阳性对照。每隔2h于倒置显微镜下观察照相。
1.2.2 HCEC凋亡的吖啶橙/溴化乙锭双染色鉴定
吖啶橙/溴化乙锭双染色参照斯佩克特等[16]的方法进行。分别收集不同方式处理8h后的HCEC，用无血清DMEM/F12培养液将细胞密度调整至2×109/L～2×1010/L。取细胞悬液0.1mL，加入吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）溶液（100mg/L AO溶液:100mg/L EB溶液=1∶1）4μL，于室温下染色1min后滴在无荧光载玻片上，加盖片后置荧光显微镜观察并拍照。每个样品至少计数300个细胞，根据细胞核呈桔红色荧光为凋亡细胞，细胞核呈亮绿色荧光为正常细胞，计算细胞凋亡率：凋亡细胞数/（正常细胞数+凋亡细胞数）×100%。
1.2.3 HCEC DNA的琼脂糖凝胶电泳
分别收集不同方式处理8h后的HCEC，用无血清DMEM/F12培养液将细胞密度调整至5×109/L～5×10910/L。每组HCEC分别加入细胞裂解液（10mmol/L TrisHCl，pH 8.0，10mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，100mg/L蛋白酶K，10g/L SDS）500μL，混匀后置55℃孵育过夜。加入终浓度为40g/L的RNA酶A于37℃下处理30min。用等体积的酚/氯仿（1∶1）、酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）和氯仿各抽提1次后，12000 r/min离心10min（4℃）收集水相，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和2倍体积的预冷无水乙醇，20℃过夜沉淀。12000r/min离心10min（4℃）收集沉淀，溶于20μL TE缓冲液中。取DNA样品5μL用15g/L的琼脂糖凝胶（含0.5mg/L EB）进行电泳，电泳后将琼脂糖凝胶置紫外检测仪中观察和照相记录。
2结果
2.1黄酮对HCEC的影响作用
55与70μmol/L黄酮处理8h后，HCEC均未出现异常形态变化；85μmol/L黄酮处理8h后，HCEC出现了大规模皱缩变圆和脱落的现象，而100μmol/L黄酮处理8h后，HCEC几乎全部呈空泡和解体状态（图1）。AO/EB双染色结果显示，55μmol/L和70μmol/L黄酮处理8h后HCEC基本上没有发生细胞凋亡，85μmol/L黄酮处理8h的HCEC约有50%发生凋亡，而100μmol/L黄酮处理8h的HCEC则几乎全部凋亡（图2）。HCEC的计数结果显示，85μmol/L和100μmol/L黄酮处理8h可分别引起53%和90%的HCEC发生凋亡（表1）。DNA电泳结果显示，55μmol/L和70μmol/L黄酮处理组HCEC的DNA在电泳图谱上与无处理组HCEC的DNA相似，而85μmol/L黄酮处理组HCEC的DNA在电泳图谱上出现了梯状条带（DNA ladder），即出现了DNA断片化，证明85μmol/L黄酮处理组HCEC确实发生了细胞凋亡；而100μmol/L黄酮处理组HCEC的DNA，在电泳图谱上条带较窄，说明多数HCEC已经解体，其DNA已无法提取出来（图3）。表1黄酮处理HCEC的细胞凋亡率（略）
2.2黄酮预处理对H2O2引起HCEC凋亡的保护作用
仅用600μmol/L H2O2处理的对照组HCEC出现明显的形态变化，而分别用55和70μmol/L黄酮预处理30min与600μmol/L H2O2再处理8h后的HCEC则大部分处于伸展状态，说明55和70μmol/L的黄酮对H2O2引起的HCEC凋亡均具有一定的拮抗作用，即对HCEC具有抗氧化保护作用；但分别经过85和100μmol/L黄酮预处理30min与H2O2再处理8h后的细胞仍会变圆和脱落，表明85和H2O2处理8h凋亡几乎没有影响（表2）。DNA的琼脂糖电泳结果显示，经70μmol/L黄酮预处理30min再用600μmol/L H2O2处理8h的HCEC，其DNA未出现梯状条带（DNA断片化），即HCEC未发生细胞凋亡，证明70μmol/L黄酮对H2O2引起的HCEC凋亡具有显著的抑制作用（图6）。表2黄酮预处理30min，H2O2再处理的HCEC细胞凋亡率（略）
[1] [2] 下一页 |
