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3讨论
活性氧自由基是一个导致角膜内皮细胞损伤的重要因素[5,6]。不仅电光性眼炎、角膜的碱烧伤等多种疾病都与自由基密切相关[8,17]，而且在角膜病治疗的手术过程中都会伴有自由基的产生，对角膜内皮细胞造成损伤[7]。此外，角膜内皮细胞在角膜的保存过程中也容易受到自由基攻击而导致功能损伤[18]。因此，寻找有效的抗氧化药物抑制自由基所造成的角膜内皮细胞损伤，对于治疗角膜疾病以及提高角膜移植手术的成功率均具有重要的应用价值。目前的研究表明，多种抗氧化剂对活性氧引起的细胞凋亡具有抑制作用，但由于合成的抗氧化剂具有毒性，故人们的研究焦点又逐渐转移到天然抗氧化剂的开发和利用上。作为天然抗氧化剂的黄酮类化合物，如3,4′二羟基黄酮[14]、黄芩素等[15]，对由H2O2引起的细胞凋亡均具有抑制作用，因而也受到了广泛关注。我们的目的就是筛选出自身不能引起凋亡又具有显著抗氧化活性的黄酮浓度，为因氧化损伤而引起的HCEC细胞凋亡的预防和治疗创造条件。我们发现，55和70μmol/L黄酮对HCEC没有毒性，不仅不会引起HCEC发生细胞凋亡，而且对由600μmol/L H2O2所引起的HCEC凋亡均具有显著的抗氧化保护作用，其中以70μmol/L黄酮的抗氧化保护作用最为显著。这与山奈酚和毛地黄黄酮在低于50μmol/L下可抑制H2O2引起的H4IIE细胞内活性氧生成及DNA损伤的研究报道是一致的[19]，但我们所用黄酮的最适抗氧化保护浓度要高一些。当黄酮的浓度为85和100μmol/L时，其自身便能引起HCEC发生不同程度的细胞凋亡，浓度越高引起HCEC发生凋亡的程度越大，而且对H2O2所引起的HCEC凋亡没有抑制作用。这与黄酮类化合物本身在一定浓度下还具有诱导细胞凋亡的作用的研究报道是一致的[20,21]，只是我们所用黄酮具有毒性作用的浓度比山奈酚和毛地黄黄酮更高一些，即毒性更小[19]。
吖啶橙（AO）和溴化乙锭（EB）是两种能与DNA结合分别发出亮绿色和橙红色的活细胞荧光染料。由于AO能透过完整质膜而EB不能，且正常细胞和凋亡细胞的膜通透性不同，因此AO/EB双染色常被用于区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞以及坏死细胞[22]。我们对黄酮处理后的HCEC以及不同黄酮浓度预处理后H2O2再处理的HCEC进行AO/EB双染色的结果显示，高浓度黄酮（85和100μmol/L）处理后的HCEC以及高浓度黄酮预处理后H2O2再处理的HCEC，许多细胞均呈现出深浅不同的橙红色荧光，进一步证实高浓度黄酮能引起HCEC发生细胞凋亡，而低浓度黄酮对H2O2所引起的HCEC凋亡具有显著的抑制作用。DNA梯状条带的出现与否已成为判定DNA是否发生片段化的直接证据，因而也是鉴定细胞凋亡与否的重要依据之一[23]。我们分别利用55，70μmol/L黄酮和/或600μmol/L H2O2处理8 h的HCEC，其DNA在琼脂糖凝胶电泳中均未出现梯状条带，即细胞未发生凋亡；而分别利用600μmol/L H2O2和85μmol/L黄酮处理8h的HCEC，其DNA在琼脂糖凝胶电泳中均出现了梯状条带，即发生了DNA片段化，细胞发生了凋亡。其中，100μmol/L黄酮处理HCEC的DNA在电泳时仅见一条较窄的条带，仅为少量残留的正常HCEC的DNA，究其原因很可能是因为此高浓度黄酮处理后，大部分HCEC已形成体积很小的凋亡小体，在离心时未能被收集所致。DNA琼脂糖凝胶电泳的结果更进一步证实，低浓度黄酮对体外培养HCEC没有毒性而高浓度黄酮能引起HCEC发生细胞凋亡，低浓度黄酮对H2O2所引起的HCEC凋亡具有显著的抑制作用而高浓度黄酮对H2O2所引起的HCEC凋亡没有抑制作用。
我们首次研究了黄酮对体外培养HCEC的影响和抗氧化保护作用，证明浓度为55μmol/L和70μmol/L的黄酮对HCEC具有显著的抗氧化保护作用，为利用黄酮预防和治疗因氧化损伤而引起的HCEC细胞凋亡提供出了理论依据，对于早日攻克HCEC凋亡所致角膜病进而实现其临床治疗也具有积极的理论和应用价值。目前，正在进行黄酮抗氧化保护作用的细胞和分子机制研究。
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