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2乳铁蛋白的表达与纯化
乳铁蛋白具有抗菌、抗病毒和免疫调控等重要的生物学功能，因此乳铁蛋白的开发应用早在上个世纪就投入了大量的研究。由于从乳汁中直接分离乳铁蛋白仅能分离到少量而且成本也较高，尤其是人乳的来源受到很大限制，所以用基因工程的方法如大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、杆状病毒表达系统和乳腺生物反应器等大规模生产将成为未来的发展趋势。乳铁蛋白特别是人乳铁蛋白基因的重组表达已成为近年来研究的热点。
2.1从乳汁中纯化
乳铁蛋白的氨基酸组成决定了它可以用阴离子交换柱层析的方法来分离纯化，过柱后将含有乳铁蛋白的洗脱液用超滤法浓缩，透析法脱盐，低温处理后做成冻干粉，或者除菌过滤后喷雾干燥。这种方法是分离纯化牛乳铁蛋白最常用的。利用乳铁蛋白对某些金属离子和带正电物质的亲和力，也可以纯化乳铁蛋白。例如，金属（铜）螯合亲和层析法、凝胶过滤层析法、肝素琼脂糖亲和层析法以及单链DNA亲和层析法[1216]。
2.2表达重组人乳铁蛋白的研究
主要受来源问题的制约，直接从乳汁中纯化的方法不适用于人乳铁蛋白的大量生产，生产成本也比较高。因此，将人乳铁蛋白基因转入可以大量繁殖的生物细胞，利用转基因的生物细胞大量生产人乳铁蛋白，不失为一种大量生产人乳铁蛋白的好方法。转基因生物细胞表达出的人乳铁蛋白在结构上和天然的人乳铁蛋白稍有差别，称为重组人乳铁蛋白（recombinant human lactoferrin, rhLF）。几十年来，表达重组人乳铁蛋白的研究已经在多种表达载体上取得了初步的成果[1720]。大肠杆菌是应用最早、研究最成熟的表达系统，繁殖速度快，操作方便，但它最大的缺陷在于没有真核表达系统的糖基化过程，因此表达出的重组蛋白与天然人乳铁蛋白在结构和活性上有较大差异。加上乳铁蛋白对大肠杆菌的生长有抑制作用，也不利于表达量的提高[21,22]。曲霉菌在自然状态下能分泌糖基化蛋白，因此它成为一种能表达糖基化蛋白的理想宿主细胞，现已用于糖基化蛋白的商业化生产。国外已经有报道，用人乳铁蛋白基因转化曲霉菌的基因,再进行适当的改造，获得较高的表达量[23,24]。毕赤氏酵母在糖基化方面很接近人细胞的糖基化方式且能分泌到细胞外，最大程度地使重组的人乳铁蛋白与天然的人乳铁蛋白在结构和生物活性上接近。多家单位在这方面进行了研究，方法已经趋于成熟但目前还没有进行商品化生产[2528]。杆状病毒能普遍感染昆虫细胞，但不能感染脊椎动物，因此作为真核蛋白表达系统具有安全性。杆状病毒中存在一种多面体基因，能大量表达，若用人乳铁蛋白基因代替此基因，可以大大提高蛋白的表达量[29,30]。此外，转人乳铁蛋白基因小鼠，转人乳铁蛋白基因牛，转人乳铁蛋白基因羊都已经获得了初步的成功，这些动物的乳汁中含有大量的人乳铁蛋白，但高等动物基因表达的调控极为复杂，还有待进一步研究[3134]。转人乳铁蛋白基因的胡萝卜、番茄、人参也获得了初步成果，但表达出的重组人乳铁蛋白的活性还有待进一步验证[3537]。
3泪液乳铁蛋白
3.1泪液乳铁蛋白与干眼的诊断
泪液乳铁蛋白由泪腺、副泪腺分泌，正常泪液的电泳分析表明，泪液中的蛋白主要有泪液前清蛋白、血清白蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白和溶菌酶，还有少量分泌性免疫球蛋白和生长因子[4]。泪液的分泌量与其他体液相比非常小，正常泪液中乳铁蛋白的含量的在1.14～1.78g/L之间。泪液乳铁蛋白含量与性别无关，但年龄在20岁以上，随年龄的增长，泪液乳铁蛋白含量逐渐降低。反射泪液中的乳铁蛋白较基础泪液中的含量高。角结膜干燥症又称干眼，是任何原因引起的泪液质和量异常或动力学异常导致的泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适，导致眼表组织病变为特征的多种疾病的总称。临床上干眼的主要检查方法泪液分泌实验（Shirmer试验）、泪膜破裂时间（BUT）、泪液蕨类试验、角结膜上皮染色、印迹细胞学检查[38]、溶菌酶含量、乳铁蛋白含量等。其中，前两项检测是比较快速简便的方法，也是临床上最常用的检测方法[39]。但这两种方法也有各自的缺点。Shirmer I试验将测试滤纸放入眼内穹窿部，难以避免一些外界的因素刺激，泪液分泌量不稳定，重复性差。由此判断干眼的标准很难确定，增加测试的特异性，敏感度就会降低。BUT测试敏感度很高，但它的特异性较低，也存在类似于Shirmer I试验的标准确定的问题，因此，BUT也只作为诊断干眼的参考，它主要是针对泪膜质量的测试[40,41]。刘景祥等研究表明，干眼症患者泪液中乳铁蛋白的量明显下降，而且泪液乳铁蛋白的含量与Shirmer I试验成正相关，与BUT也成正相关[42,43]，对干眼的诊断可以综合考虑这些检测结果。在上述这些测试方法中，泪液乳铁蛋白的含量相对比较稳定，重复性较好，如果在能改进采集泪液的方法，更有利于定量分析，同时提高干眼诊断的敏感度和特异性，使干眼的诊断更为准确。
3.2泪液乳铁蛋白检测方法
乳铁蛋白的检测方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、免疫法[44,45]。分光光度法在475nm处测定吸光值，快速简便，高效液相色谱法操作简便，都适用于检测标本量比较大的样品；但由于泪液标本的量非常少，因而准确性和特异性差，不适用于泪液中乳铁蛋白的检测；相比之下，免疫法准确性高，特异性强，对样品的纯度没有要求，应用面较广。通常实验室使用的免疫学检测法有免疫扩散法和免疫比浊法。免疫扩散法是将混有乳铁蛋白抗体的琼脂糖倾入平板，凝冻后打一些小孔，接入乳铁蛋白样品，随着抗原呈放射形扩散，在以小孔为中心的环状区域形成抗原—抗体反应沉淀带，沉淀带在免疫扩散染色液的作用下被染色，环的直径与抗原的浓度成正比。免疫比浊法是利用抗原抗体结合反应，测定溶液中抗原抗体结合形成的混浊颗粒对特定波长的光线的吸收量来定量抗原的方法。这两种方法简便易行，但灵敏度较低，抗原和抗体的量达不到最佳比值，检测结果容易出现假阳性。临床上应用的Lactoplate测试法就是利用免疫扩散法的原理检测泪液中乳铁蛋白的含量。它是将直径4mm的滤纸圆片放入穹窿部5min，滤纸浸湿后取出，做免疫扩散测定，但这种取材方法取出的泪液量很难标准化，无法对泪液中的乳铁蛋白定量，因此这种方法特异性很低，敏感度也不高[40]。目前最常用的可以定量检测乳铁蛋白的方法有酶联免疫吸附（ELISA）法和放射免疫（RIA）法[4446]。酶联免疫吸附法结合了抗原抗体特异性反应和酶的高效催化作用，该方法不但可以从细胞水平和亚细胞水平进行抗原抗体的定位，还可以定性或定量地检测各种抗原或抗体。目前检测乳铁蛋白常用的是双抗体夹心法，即乳铁蛋白与一抗特异性结合后，再与标记了辣根过氧化物酶的二抗反应，由辣根过氧化物酶催化显色反应，通过测定反应液在特定波长下的吸光值间接测定乳铁蛋白的量。放射免疫分析法应用竞争性结合的原理，放射性同素标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果，可进行超微量分析，敏感性高，常用的同位素有125I和131I。
应用免疫学的方法，需要制备特异性抗乳铁蛋白的单克隆抗体。单克隆抗体的制备涉及到饲养实验动物、细胞培养、杂交瘤的筛选等繁琐工作，周期长且一次制备抗体量有限。虞东芳等[47]利用噬菌体抗体库技术，可以保存并一次制备大量的抗人乳铁蛋白单链抗体用于双抗体夹心法酶联免疫吸附试验中，大大方便了临床泪液乳铁蛋白的检测，降低了检测成本，为乳铁蛋白的免疫学检测技术的发展开辟了新的道路，这种新的方法还需要在临床实践中进一步完善。
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