【摘要】目的：研究RGD肽对体外培养的人晶状体上皮细胞粘附与增殖的影响，为RGD肽防治晶状体后囊混浊提供理论依据。方法：将在体外分离培养的人晶状体上皮细胞中分别加入系列浓度的RGD肽(50，125，250，500，1 000mg/L)作为实验组，不含RGD肽的培养基作为对照组。以2×107个/L密度接种到预孵化含有纤维连接蛋白和I型胶原蛋白的96孔培养板中，于1h后应用MTT法检测RGD肽对细胞粘附的影响。细胞接种于培养板，加入系列浓度RGD肽（125,250,500,1 000,2 000mg/L）后的24,48,72h检测对细胞增殖的影响。结果：RGD肽对人晶状体上皮细胞粘附的抑制呈明显的剂量依赖性，随着其浓度增大，细胞粘附数就越低，500mg/L时，抑制作用最强（P<0.05）；RGD肽对人晶状体上皮细胞增殖的抑制呈明显的时间剂量依赖性，在48h，1 000mg/L RGD条件下，对细胞的抑制作用最强。结论：RGD肽可抑制晶状体上皮细胞的粘附与增殖, 具有潜在的防治后囊混浊的作用。
关键词：RGD肽; 晶状体上皮细胞; 粘附； 增殖
0引言
后发性白内障，是指白内障囊外摘除有或无人工晶状体植入术后晶状体后囊再次发生混浊,是目前白内障手术后最常见的并发症之一［1,2］,亦是白内障术后视力下降的主要原因［3,4］，是一个受多因素影响的病理过程。其发病机制主要是术后残留的晶状体上皮细胞迁徙到后囊,随之发生上皮细胞增生、胶原沉积、基底膜增厚、组织变性纤维化［5,6］。精氨酸甘氨酸天门冬氨酸 (ArgGlyAsp,RGD)作为一种可溶性小分子多肽,能竞争细胞外基质中的基质蛋白,与不同细胞表面的整合素受体结合,以阻止细胞粘附和增殖,有望成为一种预防后发性白内障形成的疗效好、副作用小的新型药物［7］。我们在建立人晶状体上皮细胞体外培养方法的基础上,应用MTT法观测不同浓度RGD肽对晶状体上皮细胞与基质粘附抑制作用及在不同观察时间下对细胞增殖的影响，为进一步动物实验模型和临床应用提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料 倒置相差显微镜(Olympus)、CO2培养箱(美国)、YJ875型超净工作台(苏州净化设备厂)、BioRad酶标仪(美国)、96孔培养板(Corning)、 DMEM培养液和进口特级胎牛血清(Gibco)、RGD合成肽（美国 Proteintech Group公司）,纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原蛋白、牛血清白蛋白（BSA）和MTT均购自（Sigma公司）。HLEB3细胞系为本实验室保存。用含200mL/L胎牛血清的DMEM培养基将人晶状体上皮细胞接种于75cm2培养瓶中，当细胞生长融合至80%时，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA消化，计数制成2×107个/L的细胞悬液，按照下述分组方法，置37℃，50mL/L CO2培养箱中继续孵育。
1.2方法
1.2.1 RGD合成肽对细胞粘附活性的影响 分别用20mg/L的纤维连接蛋白(FN)和Ⅰ型胶原蛋白（I collagen）预孵化96孔培养板，每孔加入100μL,在37℃ 、50mL/L CO2条件下包被18h,磷酸缓冲溶液(PBS)洗3次,以清除未贴壁的蛋白,然后再加入2g/L的BSA,每孔加入100μL，37℃，50mL/L CO2条件下孵育2h,以达到封闭非特异吸附位点的作用，再用PBS洗3次。将HLEB3的细胞悬液,浓度为每孔2×104,分为7组，其中5组，分别加入合成的RGD肽至终浓度为50，125，250，500，1 000mg/L，37℃孵化15min，而后将其移置到已预先处理的96孔培养板中,每组6孔，3个复孔，另2组设为无细胞的空白对照组和只含细胞的阴性对照组,分别加入培养液100μL 。每孔细胞悬液100μL，培养1h去除未贴壁的细胞，PBS洗涤3次后，每孔加入2g/L MTT试剂20μL,置37℃，50mL/L CO2培养箱培养12h,加入200g/L十二烷基硫酸钠,室温下静置6h,采用酶标仪(BioRad450)570nm波长比色测定,并计算细胞粘附率(%)。细胞粘附率=(实验组A/对照组A1)×100%。
1.2.2 RGD合成肽对细胞增殖活性的影响 将HLEB3细胞以2×104/孔密度接种于96孔培养板内，每孔加入含200mL/L 血清的DMEM培养基200μL，在37℃，50mL/L CO2饱和湿度条件下培养24h，细胞完全贴壁,吸弃培养基,加入无血清DMEM培养液(Gibco)，继续培养12h,使细胞同步化。将RGD肽用不含血清的培养基分别配制成125,250,500,1 000,2 000mg/L系列浓度作为实验组, 设无细胞的空白对照和只含细胞的阴性对照组,分别加入培养液100μL,每组设6孔，3复孔; 分别于加入后的24,48,72h后，弃培养液，每孔加入终浓度为0.5g/L的MTT 100μL。培养箱中放置4h后，加入DMSO溶液100μL，室温振荡10min，于全自动酶标仪上用490nm比色测定，测出每孔吸光度值（A）。以上实验过程在相同条件下重复1次,计算抑制率（%）=（增殖对照组平均ARGD组平均A）/增殖对照组平均A×100%。
统计学处理：采用SPSS15.0统计软件对数据进行方差分析。
2结果
2.1永生化人晶状体上皮细胞的体外培养 倒置显微镜下观察，体外培养的HLEB3 细胞生长良好,细胞形态呈多角形或不规则形，2d或3d可融合。融合成片的细胞中央部分细胞呈六边形,大小较一致（图1A）。传代时接种密度以1∶（3～4） 为适宜。传代的细胞在接种后1～2h 内即可贴壁及延伸。
2.2 RGD肽抑制人晶状体上皮细胞粘附 RGD肽对FN和Ⅰ型胶原蛋白预孵化的培养板中培养人晶状体上皮细胞的粘附均有抑制作用，方差分析结果显示P<0.01,有统计学意义（表1）。RGD浓度为50mg/L时，对细胞粘附无抑制作用(q=0.40，P>0.05)，在125mg/L浓度开始对细胞粘附有抑制作用，随着RGD 浓度的增加，抑制作用越强(图1B)；在RGD肽浓度达到500mg/L时，对细胞的粘附抑制活性达到顶峰，RGD肽浓度500mg/L组与1 000mg/L组相比，对细胞的粘附抑制率无明显差异（q=0.50，P>0.05）。
图1 培养的HLEB3细胞（×200） （略）
A:3d; B:500g/L RGD作用
表 1 RGD肽对HLEB3 细胞粘附的抑制率（略）
2.3 RGD 肽抑制人晶状体上皮细胞增殖 RGD肽对晶状体上皮细胞增殖活性的影响有明显差别（表2）。在同一作用时间下，从125mg/L 浓度RGD肽开始，对晶状体上皮细胞就有抑制作用，随着RGD肽浓度的增加，抑制作用明显增强，与对照组相比差异则有显著性(P < 0. 01) , 1 000mg/L时达到高峰。在同一浓度RGD肽作用下，随着作用时间的延长，RGD肽对晶状体上皮细胞增殖的抑制作用也增强，在48h达到高峰，48h 后各浓度组对细胞的抑制作用开始减弱。RGD肽作用浓度与作用时间存在交互作用（F=14.35，P<0.01），在RGD肽浓度为1 000mg/L，作用48h时，对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用最强(表3)。
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