【摘要】目的：研究不同浓度的高糖(HG)对人晶状体上皮细胞凋亡的作用。方法：用不同浓度的HG诱导人晶状体上皮细胞凋亡,处理组:DMEM+HG；对照组:DMEM。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测人晶状体上皮细胞的生长活性;原位末端核苷标记(TUNEL)法检测细胞凋亡的凋亡指数(AI)，并在电镜下观察TUNEL染色阳性细胞的形态及分布。结果：HG可抑制人晶状体上皮细胞生长,诱导细胞的凋亡,并呈剂量及时间依赖性, HG诱导组细胞凋亡率明显高于正常组( P<0.01)。TUNEL染色法在电镜下观察到HG诱导24h后，TUNEL染色阳性细胞核固缩或碎裂呈棕黄色，细胞大小不一；而TUNEL染色阴性细胞着色均匀，大小均一。结论：高糖具有促使人晶状体上皮细胞凋亡形成的作用,尤其是在120～150mmol/L浓度范围内。
【关键词】 高糖；凋亡；人晶状体上皮细胞
Effect of high glucose with various concentration on apoptosis of human lens epithelial cells
Shu Zhang, Hong Yan
Department of Ophthalmology, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xian 710038, Shaanxi Province, China.
Abstract
AIM: To investigate the effect of high glucose (HG) with various concentration on apoptosis of human lens epithelial cells (hLECs).
METHODS: hLECs were divided into 2 groups: the normal control group (DMEM) and the treated group (DMEM+HG). The inhibition of the HG with various concentration on activity of hLECs was analyzed by MTT chromatometry. The induction of high glucose on apoptosis of hLECs (Apoptotic Index, AI) was analyzed by the terminal deoxynucleotidy l transferasemediated dUTPbiotin nick end labeling (TUNEL) method, the morphous and distribution of the TUNELpositive cells was also observed by electron microscope.
RESULTS: The activity of hLECs was inhibited by HG, and the apoptosis of hLECs was induced by HG, with a dose and time dependence effects. TUNELpositive cells rate in the treated group was higher than that in the normal control group (P<0.01). Twentyfour hours after incubation with the HG, the nucleus of TUNELpositive cells was to be pyknoic or was broken to pieces with the dark buffy color, while the TUNEL negative cells was welldistributed with the light brown color.
CONCLUSION: Apoptosis of hLECs can be induced by HG, especially with the concentration between 120mM to 150mM.
KEYWORDS: high glucose; apoptosis; human lens epithelial cells
0引言
晶状体蛋白质的糖基化是糖尿病性白内障的主要形成因素，而由高血糖诱导的晶状体上皮细胞凋亡是白内障形成的重要细胞学基础[1，2]。我们采用不同浓度的高糖体外孵育人晶状体上皮细胞，研究其对细胞凋亡的作用。
1材料和方法
1.1材料 噻唑蓝(MTT), 二甲基亚砜(DMSO), DMEM，美国进口胎牛血清（FBS），均购自Sigma公司；原位末段标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒由南京凯基生物科技发展有限公司提供；Synergy (BioTek) 酶标仪，美国；Canon 数码摄像机, 日本；人晶状体上皮细胞系正常成人晶状体上皮细胞, 受赠于北京同仁眼科研究中心, 代号为SRA 0104。其他实验试剂和仪器均由第四军医大学唐都医院中心实验室提供。
1.2方法
1.2.1细胞的生长活性[3] 细胞培养于含100mL/L胎牛血清的DMEM中，置于50mL/L CO2，37℃培养箱中培养并进行传代、消化、种瓶、换液。将对数生长期的人晶状体上皮细胞悬液调整细胞密度为5×104/L,接种于96孔无菌培养板中,每孔200μL。实验中每孔加5种不同浓度的HG( 30，60，90，120和150mmol/L) ,正常组仅加DMEM培养液,不加HG；另设空白组(仅有培养基、无细胞)。每组每个浓度下设5个复孔，培养24h后加10μL MTT(10mg/mL)，继续培养4h后去上清液,每孔加入150μL DMSO终止反应,微振荡后,用全自动酶标仪490nm波长处读取吸光度(A)值。抑制率(% )=（A对照A实验）/（A对照 A空白）×100%。
图1HG对hLECs生长的抑制效应（略）
图2HG对hLECs凋亡的作用（略）
1.2.2凋亡细胞的原位末端核苷标记(TUNEL)法测定 TUNEL法测定凋亡细胞[4]，20×109/L的人晶状体上皮细胞悬液0.5mL，用不同浓度的HG( 30,60,90,120和150mmol/L)于37℃, 50mL/L CO2培养箱中分别孵育12，24，36，48，72和96h，经离心洗涤后涂于L－多聚赖氨酸处理的载玻片凉干，40g/L多聚甲醛室温下固1h，PBS冲洗，用渗透液(100mL/L柠檬酸钠配成100mL/L Triton X100)冰上(4℃)穿透2min, PBS冲洗，每个样本加新配制的TdT酶50μL,37℃孵育1h,终止液终止TdT酶反应,加抗地高辛过氧化物酶复合物室温孵育30min,二氨基联苯胺显色,中性树胶封片,镜下观察。阳性对照:在TdT酶处理前用DNA酶预处理;阴性对照:不经TdT酶处理。结果判定:凋亡细胞的细胞核呈棕黄色,选择凋亡密集的部位,由2名实验操作员采用双盲法计数5～10个高倍镜视野,以凋亡细胞占总细胞数的百分比作为凋亡指数。
统计学处理：采用SPSS统计学软件包(SPSS 11. 0),取均数及标准差(±s)进行方差分析和团体t检验,以P<0.05为显著性界限。
2结果
2.1 HG抑制人晶状体上皮细胞细胞生长的效应 60mmol/L的HG即可显著抑制人晶状体上皮细胞生长,且抑制率随着浓度增加及作用时间的延长而增加(图1)。人晶状体上皮细胞的半数抑制浓度( IC50)约为120mmol/L。
2.2 HG对人晶状体上皮细胞凋亡的影响 HG各处理组人晶状体上皮细胞的凋亡率均随作用时间的延长而增加(P<0.05)。在同一时间内HG各处理组人晶状体上皮细胞的凋亡率随其浓度增加而增加( P<0.05)。当HG浓度为90，120和150mmol/L组处理48h人晶状体上皮细胞凋亡率分别为(30.3±2.0) %,(40.3±2.1)% ,(49.4±2.1)%显著高于对照组(1.9±0.3)% (P<0.01,图2)。
2.3凋亡细胞分布及形态 TUNEL染色阳性细胞核固缩或碎裂呈棕黄色，细胞大小不一；而TUNEL染色阴性细胞着色均匀，大小均一（图3）。
3讨论
白内障是全球首位致盲疾病，而近年来糖尿病性白内障的发病率也逐渐增多[5]。糖基化是糖尿病性白内障的主要形成因素，而由糖基化诱导的晶状体上皮细胞凋亡是白内障形成的重要细胞学基础。凋亡是一种由基因调控的细胞程序性死亡,在凋亡发生过程中,凋亡细胞不仅发生了生化变化,而且具有凋亡的特征性细胞形态。有核细胞凋亡的一个重要特征是DNA,被内源性核酸内切酶分解为一些不连续的低分子量双股寡核苷酸片段,其碱基数为180～200bp对的整数倍,经琼脂糖凝胶电泳形成“梯形”分布的特征性区带[6] 。标记断裂点最常用的TUNEL法亦被认为是标记凋亡细胞比较可靠的组织化学方法[7]。我们采用多方法联合检测HG对人晶状体上皮细胞凋亡的作用。MTT法结果表明，HG可显著抑制人晶状体上皮细胞增殖,且抑制率随着浓度增加及作用时间的延长而增加。DNA末端标记法检测表明,HG处理组细胞凋亡率明显高于对照组,提示HG可诱导人晶状体上皮细胞的凋亡,并呈剂量及时间依赖性。在倒置电镜下观察HG处理24h后的人晶状体上皮细胞,可见TUNEL染色阳性细胞核固缩或碎裂呈棕黄色，细胞大小不一，散在分布或呈小片状分布。而TUNEL染色阴性细胞着色均匀，大小均一[8,9]。表明高浓度HG长时间可使人晶状体上皮细胞凋亡增加。
图3TUNEL阳性细胞染色（略）
a:核固缩或碎裂,阴性染色；b:着色均匀，大小均一 A:(×200);B:(×40)
既往的研究表明，晶状体上皮的凋亡是糖尿病性白内障形成的重要细胞学基础，而高血糖被认为是人晶状体上皮细胞凋亡的主要诱导因素[1，2，10]。HG诱导细胞凋亡的信号传递途径目前尚不清楚。有研究表明HG是通过干扰细胞代谢,或与蛋白质巯基及铁硫蛋白相互作用从而损伤细胞DNA，引起DNA断裂，调节凋亡调控蛋白的表达而诱导细胞发生凋亡[10]。本研究为进一步的体外高糖诱导人晶状体凋亡实验提供了重要的理论依据。
【参考文献】
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